细胞培养的基本原理与技术
现代生物技术一般认为包括基因工程技术,细胞工程技术,酶工程技术和发酵工程技术,而这些技术的发展几乎都与细胞培养有密切关系,特别是在医药领域的发展,细胞培养更具有特殊的作用和价值.比如基因工程药物或疫苗在研究生产过程中很多是通过细胞培养来实现的.基因工程乙肝疫苗很多是以CHO细胞作为载体;细胞工程中更是离不细胞培养,杂交瘤单克隆抗体,完全是通过细胞培养来实现的,既使是现在飞速发展的基因工程抗体也离不开细胞培养.正在倍受重视的基因治疗,体细胞治疗也要经过细胞培养过程才能实现,发酵工程和酶工程有的也与细胞培养密切相关.总之,细胞培养在整个生物技术产业的发展中起到了很关键的核心作用.
第一节 体外培养的概念
一,基本概念 体外培养(in vitro culture),就是将活体结构成分或活的个体从体内或其寄生体内取出,放在类似于体内生存环境的体外环境中,让其生长和发育的方法.
●组织培养:是指从生物体内取出活的组织(多指组织块)在体外进行培养的方法.
●细胞培养:是指将活细胞(尤其是分散的细胞)在体外进行培养的方法.
●器官培养:是指从生物体内取出的器官(一般是胚胎器官),器官的一部分或器官原基在体外进行培养的方法.
二,体内,外细胞的差异和分化
1.差异:细胞离体后,失去了神经体液的调节和细胞间的相互影响,生活在缺乏动态平衡相对稳定环境中,日久天长,易发生如下变化:分化现象减弱;形态功能趋于单一化或生存一定时间后衰退死亡;或发生转化获得不死性,变成可无限生长的连续细胞系或恶性细胞系.因此,培养中的细胞可视为一种在特定的条件下的细胞群体,它们既保持着与体内细胞相同的基本结构和功能,也有一些不同于体内细胞的性状.实际上从细胞一旦被置于体外培养后,这种差异就开始发生了.
2.分化:体外培养的细胞分化能力并未完全丧失,只是环境的改变,细胞分化的表现和在体内不同.细胞是否表现分化,关键在于是否存在使细胞分化的条件,如Friend细胞(小鼠红白血病细胞)在一定的因素作用下可以合成血红蛋白,血管内皮细胞在类似基膜物质底物上培养时能长成血管状结构,杂交瘤细胞能产生特异的单克隆抗体,这些均属于细胞分化行为.
第二节 细胞培养的一般过程
一,准备工作 准备工作对开展细胞培养异常重要,工作量也较大,应给予足够的重视,推备工作中某一环节的疏忽可导致实验失败或无法进行.准备工作的内容包括器皿的清洗,干燥与消毒,培养基与其他试剂的配制,分装及灭菌,无菌室或超净台的清洁与消毒,培养箱及其他仪器的检查与调试.
二,取材 在无菌环境下从机体取出某种组织细胞(视实验目的而定),经过一定的处理(如消化分散细胞,分离等)后接入培养器血中,这一过程称为取材.如是细胞株的扩大培养则无取材这一过程.机体取出的组织细胞的首次培养称为原代培养.
理论上讲各种动物和人体内的所有组织都可以用于培养,实际上幼体组织(尤其是胚胎组织)比成年个体的组织容易培养,分化程度低的组织比分化高的容易培养,肿瘤组织比正常组织容易培养.取材后应立即处理,尽快培养,因故不能马上培养时,可将组织块切成黄豆般大的小块,置4℃的培养液中保存.取组织时应严格保持无菌,同时也要避免接触其他的有害物质.取病理组织和皮肤及消化道上皮细胞时容易带菌,为减少污染可用抗菌素处理.
三,培养 将取得的组织细胞接入培养瓶或培养板中的过程称为培养.如系组织块培养,则直接将组织块接入培养器皿底部,几个小时后组织块可贴牢在底部,再加入培养基.如系细胞培养,一般应在接入培养器皿之前进行细胞计数,按要求以一定的量(以每毫升细胞数表示)接入培养器皿并直接加入培养基.细胞进入培养器皿后,立即放入培养箱中,使细胞尽早进入生长状态.
正在培养中的细胞应每隔一定时间观察一次,观察的内容包括细胞是否生长良好,形态是否正常,有无污染,培养基的PH是否太酸或太碱(由酚红指示剂指示),此外对培养温度和CO2浓度也要定时检查.
原代培养一般有一段潜伏期(数小时到数十天不等),在潜伏期细胞一般不分裂,但可贴壁和游走.过了潜伏期后细胞进入旺盛的分裂生长期.细胞长满瓶底后要进行传代培养,将一瓶中的细胞消化悬浮后分至两到三瓶继续培养.每传代一次称为"一代".二倍体细胞一般只能传几十代,而转化细胞系或细胞株则可无限地传代下去.转化细胞可能具有恶性性质,也可能仅有不死性(Immortality)而无恶性.
四,冻存及复苏(可参阅后面有关章节)为了保存细胞,特别是不易获得的突变型细胞或细胞株,要将细胞冻存.冻存的温度一般用液氮的温度-196℃,将细胞收集至冻存管中加入含保护剂(一般为二甲亚砜或甘油)的培养基,以一定的冷却速度冻存,最终保存于液氮中.在极低的温度下,细胞保存的时间几乎是无限的.复苏一般采用快融方法,即从液氮中取出冻存管后,立即放入37℃水中,使之在一分钟内迅速融解.然后将细胞转入培养器皿中进行培养.

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