青霉菌的原生质体制备技术研究
薛康平 任富亮 邢建广 王越甲
摘要:实验证明青霉菌原生质体形成最佳条件是用马铃薯液体培养基,液体震荡培养温度28℃, 培养42h,蜗牛酶的浓度为5mg/ml,酶解3.5h ,酶解温度33℃ ,稳定剂采用0.7mol/LNacl,此条件下能够制备最大量的青霉菌原生质体.
关键词:青霉菌 原生质体 蜗牛酶
1 原生质体简介
细胞壁被酶水解剥离,剩下有原生质膜包围着的原生质部分称为原生质体Weibull 等于1953年首次用溶菌酶处理巨大芽孢杆菌(Bacillus megaterium)细胞获得原生质体.其形状随不同菌类而异,革兰氏阴性菌经酶水解后细胞壁尚有残余部分,细胞具刚性,保持球形,称为原生质球或球质体;革兰氏阳性菌细胞壁去除彻底,失去刚性,原生质体类似于球体.不论原生质体或原生质球都基本保持原细胞结构,活性和功能,只是因为它们去掉了细胞壁,对渗透压特别敏感.
原生质体诱变是一种行之有效的育种新技术,它是以微生物原生质体为育种材料,采用物理或化学诱变剂处理,然后分离到再生培养基中再生,并从再生菌落中筛选高产突变菌株.Kim等于1983年首先采用该法诱变玫瑰色小单孢菌(Micromonospora rosaria)取得成功以来,应用逐渐广泛,已在抗生素,酶制剂,有机酸及维生素等高产突变株的选育中起到重要的作用.
丝状真菌原生质体的提取方法有三种:机械法,非酶分离法和酶法.采用前二种方法制备的原生质体效果差,活性低,仅适用于一些特定菌株,因此并未得到推广.在实际工作中,最有效和最常用的是酶法,该法时间短,效果好.到目前为止,适合于原生质体分离的各种酶类已经得到开发和应用.
酶法分离原生质体的方法:首先选择原始亲株,经过遗传标记筛选,得到直接亲本,采用培养皿平板玻璃纸或摇瓶震荡法培养,取年轻的菌体转入到高渗溶液中,加入有关水解酶,在一定条件下(温度,pH值等)酶解细胞壁[7].酶解后释放的原生质体和残存菌丝片断的混合液经G-2和G-3砂芯漏斗过滤,除去大部分菌丝碎片.滤液进一步低速离心10min,洗涤后弃去上清液,沉淀悬浮于同一种高渗溶液中,即可得到纯化的原生质体.酶法分离原生质体的本质是以微生物细胞壁为底物的酶水解反应,作为底物的细胞壁,其组成与结构又与培养基成分,培养条件,菌齢和预处理等因素有关.
2 材料与方法
2.1 材料
2.1.1 菌株
青霉菌,来自河北科技大学(生物科学与工程学院微生物实验室保藏菌株)
2.1.2 培养基
马铃薯低渗培养基
马铃薯等渗培养基(即含0.7mol/l NaCl的上述培养基)
2.1.3 试剂
蜗牛酶,石炭酸复红染色液,蔗糖,KH2PO4.7H2O,MgSO4,酵母膏, NaCl.
2.1.4 仪器与设备
(1)IA-1003电子天平,TGL-16C台式离心机,光学显微镜,超净台,恒温箱,电磁炉,4℃冰箱,高压灭菌锅.
(2)移液枪及枪头,1.5ml离心管,小医用注射瓶,100ml量筒,锥形瓶,培养皿,烧杯,镊子,酒精棉球,绳子,接种针,封口膜,报纸.
2.2 方法
2.2.1配制马铃薯低渗培养基
(1)称取土豆434.97g,切成小块,放入锅中煮.用纱布过滤除去土豆泥,得到土豆汁500ml.
(2)称取2g蔗糖,0.5g KH2PO4.7H2O,0.5g MgSO4,1.5g酵母膏放入烧杯中,从原土豆汁中取出160ml一并放入烧杯,再加水至500ml.
(3)取100ml于锥形瓶中,加入2g琼脂,其余的分装入3个锥形瓶.
(4)做好标记,与培养皿一起放入高压锅中灭菌.
(5)灭完菌后,固体培养基倒平板,液体培养基放入4℃冰箱保存.
2.2.2配制马铃薯等渗培养基
(1)称取0.4g蔗糖,0.1g KH2PO4.7H2O,0.1g MgSO4,0.3g酵母膏放入烧杯中,从原土豆汁中取出32ml一并放入烧杯,再加0.7mol/l的Nacl至100ml.
(2)称取2g琼脂放入烧杯中.
(3)混匀后分装入5个锥形瓶.
(4)做好标记,与培养皿一起放入高压锅中灭菌.
2.2.3 配制不同浓度的蜗牛酶液
(1)称取20mg蜗牛酶于小医用注射瓶中,并加水至2ml,此即为浓度10mg/ml的蜗牛酶液.
(2)从上述酶液中分别取80,240,400,560,720于小医用注射瓶中,并补水至800ul.

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