(紫外/可见)吸光光度法讲座(1)
吸光光度法是采用分光器(棱镜或光栅)获得纯度较高的紫外/可见单色光,基于物质对单色光的选择性吸收测定物质组分的分析方法.位于波长10~390nm之间的电磁辐射为紫外光,位于波长390~770nm之间的电磁辐射为可见光.各类电磁辐射的波长列于表1.
表1 各类电磁辐射的波长
辐 射
波长,λ/nm
无线电波
>1012~109
微 波
109~106
红
外
线
远红外
106~3×104
中红外
3×104~3×103
近红外
3×103~770
可见光
770~390
紫外线
390~10
X射线
10~10-2
γ射线
10-2~10-5
吸光光度法是一种历史久远的分析手段,具有灵敏度高,准确度和稳定性较好,适用范围广,所需仪器简单价廉等优点.它通常用于微量组分的测定,业已广泛应用于各个领域的分析测试.
吸光光度法也称做分光光度法,但是分光光度法的概念有些含糊,分光光度是指仪器的功能,即仪器进行分光并用光度法测定,这类仪器包括了分光光度计与原子吸收光谱法(AAS)仪.吸光光度法的本质是光的吸收,因此称吸光光度法比较合理,当然,称分子吸光光度法是最确切的.
紫外/可见)吸光光度法讲座(2)
——紫外与可见光吸收光谱的形成
原子或分子中的电子,总是处在某一种运动状态之中.每一种状态都具有一定的能量,属于一定的能级.这些电子由于各种原因(如受光,热,电的激发)而从一个能级转到另一个能级,称为跃迁.当这些电子吸收了外来辐射的能量就从一个能量较低的能级跃迁到一个能量较高的能级.因此,每一跃迁都对应着吸收一定的能量辐射.具有不同分子结构的各种物质,有对电磁辐射显示选择吸收的特性.正像我们在光度分析中经常见到的,有色物质的溶液对不同波长的入射光线有不同程度的吸收.吸光光度法就是基于这种物质对电磁辐射的选择性吸收的特性而建立起来的,它属于分子吸收光谱.分子吸收光谱形成中所吸收的能量与电磁辐射的频率成正比,符合普朗克条件:
ΔE=E2-E1=hν=hc/λ (l-28)
式中ΔE是吸收的能量,h为普朗克常数(6.626 ×10-34J·s),ν是辐射频率,c是光速,λ为波长.分子内部运动所涉及的能级变化较复杂,分子吸收光谱也就比较复杂.一个分子吸收了外来辐射之后,它的能量变化ΔE为其振动能变化ΔE振,转动能变化ΔE转以及电子运动能量变化ΔE 电子的总和,即
ΔE=ΔE振+ΔE转+ΔE电子 (1-29)
在等式右边三项中,ΔE电子最大,一般在1~10eV.若设ΔE电子为5eV,则得到相应的吸收光谱中被吸收光波的波长应该是
λ=hc/ΔE电子=(6.626×10-34J·s ×3 ×1010cm/s)/(5×1.6×10-19J)
=2.48×10-5cm =248nm
因此由于分子内部电子能级变化而产生的光谱位于紫外区或可见区内.ΔE振大约比ΔE电子小10倍,而ΔE转约比ΔE振小10倍或100倍.分子的电子能级跃迁必定伴随着振动能级和转动能级的跃迁,因此所得的紫外可见吸收光谱常常不是谱线或窄带,而是由一定宽度的若干谱带系所组成.
从化学键的性质来看,有机显色剂与吸收光谱有关的电子主要有三种,(1)形成单键的σ电子;(2)形成复键的π电子;(3)未共享的电子,或称非键n电子.根据分子轨道理论,这三种电子的能级高低次序是:
(σ)<(π)<(n)<(π*)C=Cn2,即只有使用折射率大于 LCC材料折射率的液体做溶剂,才能在LCC中实现全反射.例如,常用作 LCC材料的石英玻璃和耐热(Pyrex)玻璃,在20℃时对589.3nm光的折射率分别为1.459和1.474.相同条件下,水的折射率为1.333,苯和二硫化碳的折射率分别为1.501和1.627.显色反应以水为溶剂时,入射光在LCC中主要以镜面反射方式传输.为了满足全反射的条件,必须把显色物质转入(如萃取)到高折射率的溶剂中.用于全反射的溶剂可以是单一溶剂,亦可以是混合溶剂(称为混折射溶剂).
已有的研究表明,即使在镜面反射(如水作溶剂)的LCC中,灵敏度(吸光度)增加的倍率亦明显大于吸收管增长的倍率.例如,磷钼蓝法测磷,用1m的LCC比用通常1cm吸收皿灵敏度增加约300倍而不是100倍.这主要是由于吸收管壁的反射,增加了有效的吸收光程长度.在全反射条件下,由于高折射率的溶剂使入射光多重反射,进一步增大了有效的吸收光程长度,从而吸光度增加的倍率又明显高于镜面反射时的倍离,大约增至700倍.
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(紫外/可见)吸光光度法讲座(1)
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