肠杆菌(谷氨酸脱羧酶)酶粉的制备
[适用对象] 生物工程专业
[实验学时] 4学时
一,实验目的
掌握大肠杆菌谷氨酸脱羧酶酶粉的制备方法,为谷氨酸的测定准备原料.
二,实验原理
谷氨酸脱羧酶是目前测定谷氨酸所必需的工具酶,酶法测定具有专一性高,反应灵敏等特点,较少受其它因素的干扰.
三,仪器设备
恒温培养箱,高压灭菌锅,恒温摇床,水环式真空泵,冰箱,干燥器.
四,相关知识点
大肠杆菌谷氨酸脱羧酶酶粉,为谷氨酸测定的原料,因此其活性决定了形成谷氨酸量.
五,实验步骤
(一)菌种的培养
先将菌种E. coli -TS在传代培养基上培养24小时.
传代培养基配方:牛肉膏 1.0% 蛋白胨 1.0% NaCl 0.5% 琼脂:1.7%;
用50% 氨水调pH至7.2, 0.1MPa灭菌30分钟,摆成斜面.
底层平板培养基:葡萄糖0.1% 蛋白胨1% 牛肉膏1.0% 氯化钠0.5% 琼脂2.0～2.5%; pH:7.0.
上层平板培养基:葡萄糖0.1% 蛋白胨1% 牛肉膏1.0% 氯化钠0.5%; 琼脂 0.7%; pH:7.0.
上,下层培养基分装二个三角瓶,纱布牛皮纸封口后,0.1 MPa
灭菌30分钟.
(二)一级种子培养
培养基配方: 牛肉膏 5.0% 蛋白胨 4.0%
磷酸二氢钾 0.25% (分消); 用50% 氨水调pH至7.1
(三)发酵培养基
牛肉膏:2.0% 蛋白胨:1.5% 葡萄糖:0.1%
玉米浆粉: 0.1% 磷酸二氢钾:0.25%(分消)用50% 氨水调pH至7.1
装量:1000毫升三角瓶装200毫升 灭菌:0.1MPa,20分钟.冷却后接种,接种量5%,接种后在36℃摇床上培养.摇床转速:往复式为97转/分,旋转式为170转/分.
(四)收集菌体
将摇瓶中的发酵液收集后,用冷冻离心机离心,收集菌体.菌体用蒸馏水洗二次.
(五)制备冷冻干粉
将菌体用少量蒸馏水制成菌悬液,加入10倍体积的冷冻丙酮(-18℃),搅拌均匀,真空抽滤,将滤下的菌体再用5倍冷冻丙酮搅拌均匀,真空抽滤.将菌体加入5倍体积的冷冻乙醚(-18℃)脱水,抽滤后将菌粉放在干燥器内,放入冰箱二天,二天后将菌粉过筛,测定酶活性
六,实验报告要求
实验报告书写统一格式,实验全部完成后,统一交阅,且要求写实验心得.
七,思考题
影响谷氨酸脱羧酶活性的因素有哪些
八,实验成绩评定办法
主要评分点:原理描述,实验流程,数据记录,解决问题的能力,实验结果等.平时和实验报告各占1/2.