周期牵张肺上皮II型细胞导致IL-8分泌增加的机制研究
王月兰1,2 姚尚龙 1
1姚尚龙,华中科技大同济医学院协和医院麻醉科,430022,武汉,湖北
2王月兰,华中科技大同济医学院协和医院麻醉科
通讯作者:王月兰
通讯地址:山东省千佛山医院麻醉科,邮编250014
联系电话:(山东);(武汉)
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[摘要] 目的 周期性牵张离体A549细胞,观察C-Jun氨基末端激酶(JNK)的活性及IL-8基因和蛋白的表达变化,探讨IL-8分泌的机制和JNK在此过程中的作用.方法 A549细胞的培养 人类肺上皮细胞癌,即A549细胞株,培养于10%胎牛血清的DMEM培养基中.在37℃,5%CO2 ,湿度约60%的细胞培养箱中培养48h至亚融合,用胰酶消化处理将之以密度为1×106细胞种植在细胞牵张仪特制的硅胶树脂膜上(美国进口),再置于细胞培养箱中孵育48h后备用.细胞牵张 试验前取出细胞爬膜镜下观察细胞生长至亚融合后,用DMEM培养基轻轻冲洗细胞爬膜,然后将膜置于细胞牵张仪的细胞盘中,加入4mlDMEM,仍置于细胞孵育箱中,调整牵张仪至细胞体积扩大15%,30个周期/min (30cycles/min,每分钟30次扩张与缩回),分别持续0,15,30,60,120分钟5个时间点.用药组在牵张前30分钟将SP600125按照50μmol/L进行孵育后再进行上述处理.体外培养的A549细胞种植于细胞牵张仪的硅胶树脂膜上,培养48h后行周期牵张.预处理组则将JNK抑制剂SP600125加入培养基中孵育30min后再进行细胞牵张.分别采用ELISA,RT-PCR方法测定牵张后的细胞悬液及细胞中IL-8蛋白含量和基因表达;Western blot技术测定JNK和p-JNK在不同时期的蛋白表达和活性变化.结果 1,IL-8 mRNA表达变化:未处理组在细胞体积被牵张扩大15%15分钟时,IL-8基因表达与未牵张时无显著差异(P>0.05);30分钟时基因表达开始增加,且随时间延长而增多,120分钟时达高峰,与牵张0,15,30分钟比较有显著差异(P<0.05).当给予SP6700125孵育预处理后各时间点的IL-8表达均被抑制,较未处理组其表达量显著降低(P0.05);30分钟后开始增加,60和120分钟较前三个时间点显著增加(P0.05).3,JNK和p-JNK表达的变化:A549细胞总JNK蛋白表达随牵张时程的延长而增加,但组间差异无统计学意义;磷酸化的JNK(p-JNK)却随牵张时间的延长表达增多,60,120分钟时分别是牵张15分钟的2和3倍;SP600125 预处理后各时间点的磷酸化水平与未处理组比较显著被抑制(P<0.05).结论 周期牵张A549导致IL-8分泌增加且该机制至少部分是依赖JNK激活而产生.
[关键词] 周期牵张 ;肺损伤;应激活化蛋白激酶; 细胞因子