天然药物化学课程教案 课次 1 授课方式 (请打√) 理论课√ 讨论课 实验课 习题课 其他 课时 安排 3 授课题目: 黄酮类化合物 第一节 概述 黄酮类化合物的理化性质及显色反应 教学目的和要求: 1、掌握黄酮类化合物的概念、结构分类及代表物的化学结构. 2、掌握黄酮类化合物的性质. 3、熟悉黄酮类化合物的生物合成途径. 4、了解黄酮类化合物的生物活性. 教学重点及难点: 重点: 1、黄酮类化合物的结构分类及代表物的化学结构. 2、黄酮类化合物的性质. 难点: 黄酮类化合物的生物合成途径和性质. 教学基本内容方法及手段 第一节 概述一、定义 黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环(A-环与B-环)通过中央三碳原子相互连接而成的一系列化合物. 二、黄酮类化合物的生物合成途径 合成黄酮类化合物的桂皮酸途径 黄酮类化合物的生物合成途径 三、黄酮类化合物的结构分类 1、结构分类依据 根据中央三碳链的氧化程度、B-环连接位置(2-位或3-位)、以及三碳链是否构成环状等特点,可将主要的天然黄酮类化合物分类. 2、黄酮类化合物的主要结构类型 名称 结构母核 黄酮类 Flavones 代表物: 黄芩苷 木犀草素 清热、解毒、消炎,用于急、抗菌、抗炎、解痉、祛痰、抗癌 慢性肝炎,上呼吸道感染. 名称 结构母核 黄酮醇类 Flavonols 代表物: 芦丁 槲皮素 维生素P样作用,降低血管脆性 及异常的通透性.为防治高血压 扩冠、抗血栓 及动脉硬化的辅助治疗药物. 名称 结构母核 二氢黄酮类 Flavanones 代表物: 名称 结构母核 二氢黄酮醇类 Flavanonols 代表物: 水飞蓟素 抗肝炎药 名称 结构母核 异黄酮类 Isoflavones 代表物: 扩张冠脉改善冠脉循环、脑循环 及周围血管微循环 雌激素样作用解痉、抗缺氧作用 3、结构分类表 名称 结构母核 二氢异黄酮类 Isoflavanones 查耳酮类 Chalcones 二氢查耳酮类 Dihydrochalcones 花色素类 Anthocyanidins 黄烷-3,4-二醇类 Flavan-3,4-diols ? 双苯吡酮类(酮类) Xanthones ? 黄烷-3-醇类 Flavan-3-ols ? 橙酮类(噢弄类) Aurones 高异黄酮类 Homoisoflavones 4、黄酮类化合物的存在形式 (1) 与糖结合成苷:单糖苷、双糖苷、三糖苷; O-苷、C-苷. (2) 游离体 四、黄酮类化合物的生物活性 1、对心血管系统的作用 2、抗肝脏毒作用 3、抗炎作用 4、雌性激素样作用 5、抗菌及抗病毒作用 6、泻下作用 7、解痉作用 多媒体 讲解黄酮类化合物的理化性质及显色反应 一、性状 1、形态 黄酮类化合物大多数为结晶性固体,具有一定的结晶形状,少数为非晶形粉末. 2、旋光性 二氢黄酮(醇)、二氢异黄酮、黄烷醇具有旋光性,其它黄酮类不具有旋光. 黄酮苷由于结构中引入糖基具有旋光性,为左旋. 3、颜色 黄酮类化合物多呈黄色,所呈现的颜色与分子中是否存在交叉共轭体系及助色团(如—OH,-OCH3等)的数目多少和取代的位置有关,如果4'或7位上引入供电子基,如-OH,-OCH3等,因形成p-π共轭,具有共轭作用,促进电子转移,重排使化合物的颜色加深.但在其它位置上引入—OH,-OCH3时影响较小,如果C2-C3间的双键被氢化,则交叉共轭体系中断,故二氢黄酮和二氢黄酮醇几乎无色,异黄酮共轭很少,即显微黄色.花色素所显的颜色,随pH不同而改变,一般pH<7显红色,pH8.5紫色,pH>8.5显蓝色.pH不同可能促进结构产生可逆变化. 花青素: 二、溶解性 游离黄酮:难溶于或不溶于水,以溶于甲醇、乙醇、醋酸乙酯、乙醚等有机溶剂及稀碱液中.(黄酮、黄酮醇、查尔酮) 原因:因它们的分子中存在着交叉共轭体系,所以是一些平面型化合物,平面型分子堆砌得较紧密,分子间的引力较大,故很难溶于水.二氢黄酮和二氢黄酮醇由于分子中吡喃环已被氢化,称为近似于半椅式结构,破坏了分子的平面型,使分子排列不紧密,分子间引力降低,有利于水分子的进入,因而在水中溶解度比平面型分子稍大. 异黄酮类化合物由于B环受吡喃环羰基的立体阻碍,也不是平面分子,故亲水性比平面型分子增加. 花色素类虽然属于平面型结构,但因以离子形式存在,具有盐的通性,故水溶性较大.游离黄酮苷元中引入的取代基的种类和数目不同,对溶解度影响也不同. 引入OH:水溶性增加,脂溶性降低.引入OCH3或异戊烯基:脂溶性增加,水溶性降低. 黄酮苷以溶于热水,甲醇,乙醇,吡啶醋酸乙酯,稀碱液中,难溶或不溶于低极性有机溶剂. 三、酸性与碱性 (一)酸性 黄酮类化合物因分子中具有酚-OH,故显酸性,可溶于碱性水溶液、吡啶中,其酸性强弱与酚-OH数目的多少和位置有关,黄酮的酚-OH酸性由强到弱顺序是: 7,4'-二OH>7或4'-OH>一般酚-OH>5-OH (二)碱性 黄酮类化合物分子中γ-吡喃环上的一位氧原子,因有未共用电子对,故表现出微弱的碱性,可与强无机酸生成盐,生成的盐不稳定,加水后即可分解.黄酮类化合物溶于浓硫酸生成的洋盐,常常表现出特殊的颜色,可用于鉴别. 四、显色反应 黄酮类化合物的颜色反应多与分子中的酚-OH及γ-吡喃酮环有关: 类别 黄酮 黄酮醇 二氢黄酮 查耳酮 异黄酮 橙酮 盐酸-镁粉 黄→红红→紫红 红、紫、蓝———盐酸-锌粉 红 紫红 紫红 — — — 硼氢化钠 — — 蓝→紫红 — — — 硼酸-柠檬酸 绿黄 绿黄 — 黄——醋酸镁 黄黄蓝黄黄—三氯化铝 黄 黄绿 蓝绿 黄黄淡黄 氢氧化钠水溶液 黄 深黄 黄→橙(冷) 深红→紫(热) 橙→红黄红→紫红 浓硫酸 黄→橙黄→橙橙→紫橙、紫黄红、洋红 (一)还原试验 1、HCl-Mg(Zn)粉反应:是检查中药中是否有黄酮类化 合物的最常用的方法. 操作:在样品的乙醇或甲醇溶液中加入少许镁粉振摇,再滴加几滴浓盐酸(必要时在水浴上加热). 结果:黄酮(醇),二氢黄酮(醇)——橙红~紫红色B环上有-OH,或OCH3取代时颜色加深;查耳酮、橙酮、儿茶素、异黄酮——不显色. 2、NaBH4反应:是对二氢黄酮类专属性较高的还原剂,与 二氢黄酮反应,还原生成红~紫红色的物质,其他黄酮类均为负反应,故可用于和其他黄酮类区别. (二)金属盐类试剂的络合反应 黄酮类化合物分子中若具有3-OH、4-酮基或邻二酚-OH,可与铝盐,锆盐、镁盐、铅盐反应,生成有色络合物. 铝盐 试剂:1%AlCl3的甲醇溶液,生成的络合物为黄色,并在415nm有荧光,可用于定性及定量. 铅盐 醋酸铅可与具有邻二酚-OH、3-OH ,4-酮基或5-OH, 4-酮基的黄酮类化合物产生沉淀. 碱式醋酸铅与一般酚类化合物均可产生沉淀.据此不仅可用于鉴定,也可用于提取分离工作. 3、锆盐 2%ZrOCl2的甲醇溶液,可以用来区别黄酮类化合物分子中3或5-OH的存在,加2%ZrOCl2的甲醇溶液到样品的甲醇溶液中,若出现黄色,说明有3-OH或5-OH与锆盐生成络合物,再加入2%枸橼酸的甲醇溶液黄色不褪示有3-OH,如果黄色减退,加水稀释后转为无色,示无3-OH,但有5-OH.因为5-OH 4-酮基与锆盐生成的络合物稳定性没有3-OH,4-酮基锆络合物稳定,容易被弱酸分解. 4、镁盐 1%醋酸镁甲醇溶液,可在纸上反应.样品点于滤纸上,喷1%醋酸镁甲醇溶液,加热干燥后在紫外灯下观察: 二氢黄酮、二氢黄酮醇——天蓝色荧光 黄酮(醇)、异黄酮——黄~橙黄~褐色 5、氨性氯化锶反应 专门检查邻二酚-OH生成绿~棕色乃至黑色沉淀. FeCl3反应 常用的酚类显色剂.多数黄酮类化合物因分子中含有酚羟基,故可产生阳性反应,但一般仅在含有氢键缔合的酚羟基时,才呈现明显的颜色. (三)硼酸显色反应 5-OH黄酮及2-OH查耳酮,在无机酸或有机酸存在的条件下,与硼酸反应生成亮黄色. (四)碱性试剂显色反应 1、二氢黄酮类在碱液中开环——生成查耳酮类 2、黄酮醇在碱液中——黄色+空气——棕色可与黄酮类区别. 3、黄酮类化合物具有邻二酚羟基及3,4'-二OH在碱液中易氧化—黄色变成深红色—绿棕色沉淀.根据这些颜色变化,可以粗略地提示属于哪类化合物. 思考题: 比较下列化合物的酸性大小,并说明理由. A B C 2、比较下列化合物极性大小,如以硅胶作为固定相,正丁醇-醋酸-水(4:1:5)上层为展开剂,说明这几个化合物在薄层色谱中的Rf值大小顺序. A B C 3、鉴别下列化合物 (1) A B C (2) A B C 教法设计: PowerPoint 加板书 教学时数:第二节讲2个学时 天然药物化学课程教案 课次 2 授课方式 (请打√) 理论课 讨论课 实验课 习题课 其他 课时 安排 3 授课题目: 黄酮类化合物 第三节 黄酮类化合物的提取与分离 黄酮类化合物的检识与结构鉴定 教学目的和要求: 1、掌握黄酮类化合物提取常用的方法. 2、掌握黄酮类化合物分离常用的方法. 3、掌握紫外及可见光谱在黄酮类化合物鉴定中的应用. 4、熟悉色谱法在黄酮类化合物鉴定中的应用. 5、熟悉黄酮类化合物用聚酰胺柱色谱分离时的洗脱规律. 教学重点及难点: 重点: 1、黄酮类化合物提取常用的方法. 2、黄酮类化合物分离常用的方法. 3、紫外及可见光谱在黄酮类化合物鉴定中的应用. 难点: 1、紫外及可见光谱在黄酮类化合物鉴定中的应用. 2、黄酮类化合物用聚酰胺柱色谱分离时的洗脱规律. 教学基本内容方法及手段 黄酮类化合物的提取与分离 一、提取 黄酮类化合物在花、叶、果等组织中,一般多以苷的形式存在,而在木部坚硬组织中,则多为游离苷元形式存在. 黄酮苷类以及极性稍大的苷元(如羟基黄酮、双黄酮、橙酮、查耳酮等),一般可用丙酮、醋酸乙酯、乙醇、水或某些极性较大的混合溶剂进行提取.其中用得最多的是甲醇-水(1:1)或甲醇. 一些多糖苷类则可以用沸水提取.花青素类可加入少量酸(如0.1%盐酸).但提取一般黄酮苷类成分时,则应当慎用,以免发生水解反应.为了避免在提取过程中黄酮苷类发生水解,也常按一般提取苷的方法事先破坏酶的活性. 大多数黄酮苷元宜用极性较小的溶剂,如用氯仿、乙醚、醋酸乙酯等提取,而对多甲氧基黄酮的游离苷元,甚至可用苯进行提取. (一)溶剂萃取法 原理:利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同,选用不同溶剂进行萃取可达到精制纯化的目的. 例如:(1)植物叶子的醇浸液,可用石油醚处理,以便除去叶绿素、胡萝卜素等脂溶性色素. (2)某些提取物的水溶液经浓缩后则可加入多倍量 浓醇,以除去蛋白质、多糖类等水溶性杂质. 有时溶剂萃取过程也可以用逆流分配法连续进行.常用的溶剂系统有水-醋酸乙酯、正丁醇-石油醚等. 溶剂萃取过程在除去杂质的同时,往往还可以收到分离苷和苷元或极性苷元与非极性苷元的效果. (二)碱提取酸沉淀法 原理:黄酮苷易溶于碱性水、难溶于酸性水,故可以用碱性水提取,在将碱水提取液调成酸性,黄酮苷类即可沉淀出来. 此法简便易行,工厂大量生产时液采用此法.在用碱酸法进行提取纯化时,应当注意所用碱液浓度不宜过高,以免在强碱性下,尤其加热时破坏黄酮母核,在加酸酸化时,酸性液不宜过强,以免生成洋盐,致使析出的黄酮类化合物又重新溶解,降低产品收率.当药材中含有大量果胶、粘液质等水溶性多糖成分时,宜用石灰乳或石灰水代替其它碱性水溶液进行提取,使含有羧基的杂质生成钙盐沉淀,不被溶出. (三)碳粉吸附法 适用范围:苷类的精制工作. 操作:甲醇提取液中,分次加入活性炭,直至上清液的黄酮反应为阴性.收集吸附黄酮苷的碳末,依次用沸水、沸甲醇、7%酚-水、15%酚-醇溶液洗脱.大部分黄酮苷在7%酚-水洗下减压浓缩、乙醚振荡除去残留的酚.水层减压浓缩精制黄酮苷. 二、分离 (一)柱色谱法 常用的吸附剂或载体:硅胶,聚酰胺,纤维素粉,氧化铝,氧化镁,硅藻土. 1、硅胶柱色谱 主要适于分离异黄酮,二氢黄酮,二氢黄酮醇,高度甲基化的黄酮及黄酮醇类. 2、聚酰胺柱色谱 聚酰胺是分离黄酮类化合物的首选吸附剂,因为聚酰胺吸附容量大,分离效果好.其吸附强弱主要取决于黄酮类化合物分子中羟基的数目与位置一溶剂与黄酮类化合物或聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小. 适用范围:黄酮苷,苷元,查尔酮,二氢黄酮. 黄酮类化合物从聚酰胺柱上洗脱时规律(先→后): (1)苷元相同:叁糖苷-双糖苷-单糖苷-苷元 (2)母核上增加羟基,洗脱速度相应减慢. 羟基位置对吸附也有影响:邻位羟基黄酮-对位(间位)羟基黄酮. (3)不同类型黄酮:异黄酮-二氢黄酮醇-黄酮-黄酮醇 (4)芳香核、共轭双键多者易被吸附:二氢黄酮-查尔酮 3、葡聚糖凝胶(Sephadex gel)柱色谱 常用的型号:Sephadex G和Sephadex LH-20 原理:分离游离黄酮时,主要靠吸附作用.凝胶对黄酮类化合物的吸附程度取决于游离酚-OH的数目,分离黄酮苷时,则分子筛的性质起主导作用.在洗脱时,黄酮苷类大体上按分子量的大小洗下来. 举例说明: 化合物 取代图式 Ve/Vo 芹菜素 5.7.4-三OH 5.3 木犀草素 5.7.3'.4'-四OH 6.3 槲皮素 3.5.7.3'.4'-五OH 8.3 杨梅素 3.5.7.3'.4'.5'.-六OH 9.2 山奈酚-3-半乳糖 鼠李糖-7-鼠李糖苷 三糖苷 3.3 槲皮素-3-芳香糖苷 双糖苷 4.0 槲皮素-3-鼠李糖苷 单糖苷 4.7 常用的洗脱剂: (1)碱性水溶液(0.1mol/L NH4OH),含盐水溶液(0.5mol/L NaCl) (2)醇及含水醇如甲醇、甲醇-水(不同比例)、t-丁醇-甲醇(3:1)、乙醇等. (3)其它溶剂,如含水丙酮、甲醇-氯仿等. (二)梯度PH萃取法 适用范围:分离酸性强弱不同的黄酮苷元. 操作:将混合物溶于有机溶剂后,依次用5%NaHCO3、5% Na2CO3、0.2%NaOH及4%NaOH溶液萃取. 酸性:7,4'-OH > 7-或4'-OH>一般酚OH >5-OH 溶于NaHCO3中 溶于Na2CO3 溶于不同浓度的NaOH (三)根据分子中某些特定官能团进行分离 具有邻二酚-OH的可与醋酸铅产生沉淀.不具有邻二酚-OH的可被碱式醋酸铅沉淀.也可以利用硼酸络合法.具有邻二酚-OH的黄酮类化合物可与硼酸络合,生成易溶于水.借此可与无邻二酚-OH的黄酮类化合物相互分离. (四)其他方法 近年来,黄酮类化合物的分离也应用HPLC法. 多媒体 讲解黄酮类化合物的检识及结构鉴定 黄酮类化合物的鉴别与结构测定现在多依赖于波谱学的综合解析.未知黄酮类化合物的鉴定.多在测定分子式的基础上.利用PC或TLC得到的Rf值与文献比较.或分析对比样品在甲醇溶液中加入各种渗透试剂后得到的紫外及可见光谱进行剖析.同时,对于化合物的颜色反应,以及在提取分离中所表现的行为.(如溶解度,酸或碱中的溶解情况,铅盐沉淀等)也应注意分析. 近年来由于仪器分辨率的不断改进,1H-NMR、13C-NMR、FD-MS、FAB-MS已成为黄酮类化合物结构鉴定的重要手段. 一、色谱法在黄酮类化合物鉴别中的应用 (一)纸色谱(PC) 适用范围:分离各种天然黄酮类化合物及其苷类的混合物. 双相色谱:第一向:醇性溶剂:正丁醇:醋酸:水(4:1:5),(根据分配原理) (上层);水饱和正丁醇 第二向:水性溶剂:2-6%醋酸,3%氯化钠(根据吸附原理)醋酸-浓盐酸-水(30:3:10) 黄酮苷元:醇性溶剂:苯-醋酸-水(125:72:3) 氯仿-醋酸-水(13:6:1) 苯酚-水(4;1) 花色苷及苷元:含HCl或HOAc的溶液 显色: ①用紫外灯检查,以氨蒸气处理后观察颜色的变化. ②喷2%AlCl3/CH3OH——紫外灯下观察 ③1%FeCl3-1%K3Fe(CN)6(1:1)水溶液. 结构与Rf值的关系: 黄酮、黄酮醇、查尔酮: 在水性溶液中(3-5%HoAc)(平面型分子)Rf < 0.02—几乎停留在原点. 二氢黄酮(醇), 二氢查尔酮: 在水性溶剂中Rf 0.10-0.30 (非平面型分子,亲水性较强) 在醇性溶剂中同一类型苷元的Rf值为:苷元>单糖苷>双糖苷 BAW中展开:苷元Rf>0.70 ,苷<0.70 ;在水性溶剂中相反. (二)硅胶薄层色谱(TLC) 适用范围:分离和鉴定弱极性黄酮类化合物. 分离黄酮苷元的展开剂:甲苯-甲酸甲酯-甲酸(5:4:1) 根据待分离成分极性大小适当调整甲苯与甲酸的比例. (三)聚酰胺薄层色谱 适用范围:分离含游离酚羟基的黄酮及其苷类,因聚酰胺对黄酮类化合物的吸附能力强,故选择极性较强的展开剂: 乙醇:水(3:2) 水:乙醇:乙酰丙酮(4:2:1) 水:乙醇:甲酸:乙酰丙酮(5:1.5:1:0.5) 水饱和正丁醇:醋酸(100:2) 丙酮:水(1:1) 二、紫外及可见光谱在黄酮类鉴定中的应用 程序: 1、测定样品在甲醇溶液中的UV及可见光谱. 2、测定样品在甲醇溶液中加入各种诊断试剂后得到的UV及可见光谱. 3、各种UV光谱对比,可推测黄酮类化合物的结构类型及羟基位置. * 苷类可先水解或进行甲基化后再水解,测定苷元或衍生物的UV光谱. 诊断试剂: 向黄酮类化合物的甲醇(或乙醇)溶液中分别加入甲醇钠、乙酸钠、乙酸钠-硼酸、三氯化铝或三氯化铝-盐酸试剂能使黄酮的酚羟基离解或形成络合物等,导致光谱发生变化.据此变化可以判断各类化合物的结构,这些试剂对结构具有诊断意义,称为诊断试剂. (一)黄酮类化合物在甲醇溶液中的UV光谱 黄酮和黄酮醇等多数黄酮类在200-400nm区域内存在两个主要的紫外吸收带. 苯甲酰基 峰带II 桂皮酰基 峰带I 220-280nm (组成交叉共轭体系) 300-400nm 表5-1 黄酮类化合物UV吸收范围(nm) 带II 带I 黄酮 250—280 310—350 黄酮醇(3-OH取代) (3-OH游离) 250—280 250—280 330—360 350—385 异黄酮 245—275 310—330(sh) 二氢黄酮(醇) 275—295 300—330(sh) 查耳酮 230—270(低强) 340—390 橙酮 230—270(低强) 380—430 花色素及其苷 270—280 465—560 取代基及其位置对黄酮化合物的影响: 无论A环、B环,增加羟基数目均使相应谱带红移. 羟基甲基化及糖苷化使相应谱带紫移. 羟基乙酰化使原羟基的影响消失. 1、黄酮及黄酮醇类 两者的UV光谱相似,但带I位置不同.黄酮带I 310-350nm;黄酮醇带I 350-385nm.黄酮、黄酮醇母核上,7-及4'-引入-OH,-OCH3等供电基,相应吸收带向红位移. 化合物 带I (λmaxMeOH, nm) 3,5,7-三羟基黄酮(高良姜素) 359 3,5,7,4'-四羟基黄酮(山柰酚) 367 3,5,7,3',4'-五羟基黄酮(槲皮素) 370 3,5,7,3',4' ,5 '-六羟基黄酮(杨梅素) 374 带II的峰位主要受A环氧取代程度的影响,A环上的含氧取代基增加时,带II向红位移,而对带I无影响,或影响甚微. 2、查耳酮及橙酮类 特征:带I很强为主峰,带Ⅱ比较弱,为次强峰. 查耳酮:带II位于220-270nm 带I位于340-390nm 橙酮:带I位于370-430nm 带II位于388-413nm——天然橙酮 3、异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇 因B环不与吡喃酮环上的羰基共轭,故带I很弱,常在主峰的长波方向处有一肩峰.异黄酮主峰在245-270nm;二氢黄酮(醇)主峰在270-295nm. (二)加入诊断试剂后引起的位移及其在结构测定中的意义 当向黄酮类化合物的甲醇溶液中分别加入诊断试剂NaOMe,NaOAc,NaOAc-H3BO3,AlCl3或AlCl3-HCl时,由于诊断试剂黄酮类化合物母核上的酚羟基产生不同程度的解离或与黄酮类化合物生成络合物等,导致UV光谱发生变化,据此变化以判断黄酮类化合物的结构. 1、NaOMe 甲醇钠碱性较强,可使黄酮类化合物母核上所有酚羟基解离,导致相应吸收带向红位移. ①如带I位移40-60nm,强度不变或增强,则示有4'-OH. ②如带I红移50-60nm,强度减弱,则示有3-OH,但无4'-OH. ③7-OH游离:320-330nm有吸收,成苷:该吸收消失. ④含有3,4'-OH,或3,3',4'-OH,5,6,7或5,7,8或5,3',4'-OH的黄酮,在甲醇钠碱性氧化分解,吸收带随测定时间延长而衰退. 2、NaOAc 醋酸钠的碱性比甲醇钠小,只能是黄酮类化合物母核上酸性较强的酚羟基解离. ①7-OH:带II向红位移5-20nm. ②4'-OH:带I红移40-65nm,强度下降 ③对碱敏感的基团——吸收谱图随时间延长而衰退. 3、NaOAc-HBO3 黄酮或黄酮醇类化合物的A环或B环上如果具有邻二酚羟基时,在NaOAc碱性下可与 H3BO4络合,使相应吸收带向红位移,B环有邻二酚羟基时,带I向红位移12-30nm,A环有邻二酚羟基带II向红位移5-10nm. 黄酮类化合物与硼酸形成的络合物 4、AlCl3及AlCl3/HCl AlCl3可与具有3-OH,4-羰基或5-OH,4-羰基的黄酮醇类化合物作用生成络合物,使带I或带II向红位移,AlCl3也能与A环或B环上的邻二酚羟基作用生成络合物,使相应的吸收带向红位移,但所形成的络合物不稳定,当加入HCl后即可分解,使相应的吸收带向紫位移. ①AlCl3/HCl谱图=AlCl3谱图,示结构中无邻二酚羟基. ②AlCl3/HCl谱图≠AlCl3谱图,示结构中有邻二酚羟基. 带I紫移30-40nm,示B环可能有邻二酚羟基. 带I紫移50-60nm,示A、B环均可能有邻二酚羟基. 带I紫移20nm,示有邻三酚羟基. ③ AlCl3/HCl谱图=MeOH谱图,示无3-及/或5-OH. ④ AlCl3/HCl谱图≠MeOH谱图,示有3-及/或5-OH. 带I红移35-55nm,示只有5-OH. 带I红移60nm,示只有3-OH. 红移50-60nm ,示可能同时有有3-及5-OH. 红移17-20nm ,示除有5-OH外尚有6-含氧取代. 黄酮类化合物与AlCl3形成的络合物 注:测定时多选用甲醇作UV光谱测定的溶剂,如果以乙醇作测定溶剂,其中含有的痕迹量水分可以抑制AlCl3与邻二酚羟基形成络合物. 以上所述为一般经验规律.实践中常需要结合化学方法及其它光谱法综合分析.如邻二酚羟基可用氨性氯化锶反应来加以识别.3或5-OH可用锆-枸橼酸反应识别. 思考题: 1、黄酮类化合物的提取分离方法有哪些?原理是什么? 2、某中药材中含有如下成分:①多糖 ②芦丁 ③槲皮素,若采用下列流程进行分离,请将各成分填入括号内. 多媒体 讲解
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天然药物化学课程教案 课次 1 授课方式 (请打√) 理论课√ 讨论课 实验课 习题课 其他 课时 安排 3 授课题目: 黄酮类化合物 第一节 概述 黄酮类化合物的理化性质及显色反应 教学目的和要求: 1、掌握黄酮类化合物的概念、结构分类及代表物的化学结构. 2、掌握黄酮类化合物的性质. 3、熟悉黄酮类化合物的生物合成途径. 4、了解黄酮类化合物的生物活性. 教学重点及难点: 重点: 1、黄酮类化合物的结构分类及代表物的化学结构. 2、黄酮类化合物的性质. 难点: 黄酮类化合物的生物合成途径和性质. 教学基本内容方法及手段 第一节 概述一、定义 黄酮类化合物泛指两个具有酚羟基的苯环(A-环与B-环)通过中央三碳原子相互连接而成的一系列化合物. 二、黄酮类化合物的生物合成途径 合成黄酮类化合物的桂皮酸途径 黄酮类化合物的生物合成途径 三、黄酮类化合物的结构分类 1、结构分类依据 根据中央三碳链的氧化程度、B-环连接位置(2-位或3-位)、以及三碳链是否构成环状等特点,可将主要的天然黄酮类化合物分类. 2、黄酮类化合物的主要结构类型 名称 结构母核 黄酮类 Flavones 代表物: 黄芩苷 木犀草素 清热、解毒、消炎,用于急、抗菌、抗炎、解痉、祛痰、抗癌 慢性肝炎,上呼吸道感染. 名称 结构母核 黄酮醇类 Flavonols 代表物: 芦丁 槲皮素 维生素P样作用,降低血管脆性 及异常的通透性.为防治高血压 扩冠、抗血栓 及动脉硬化的辅助治疗药物. 名称 结构母核 二氢黄酮类 Flavanones 代表物: 名称 结构母核 二氢黄酮醇类 Flavanonols 代表物: 水飞蓟素 抗肝炎药 名称 结构母核 异黄酮类 Isoflavones 代表物: 扩张冠脉改善冠脉循环、脑循环 及周围血管微循环 雌激素样作用解痉、抗缺氧作用 3、结构分类表 名称 结构母核 二氢异黄酮类 Isoflavanones 查耳酮类 Chalcones 二氢查耳酮类 Dihydrochalcones 花色素类 Anthocyanidins 黄烷-3,4-二醇类 Flavan-3,4-diols ? 双苯吡酮类(酮类) Xanthones ? 黄烷-3-醇类 Flavan-3-ols ? 橙酮类(噢弄类) Aurones 高异黄酮类 Homoisoflavones 4、黄酮类化合物的存在形式 (1) 与糖结合成苷:单糖苷、双糖苷、三糖苷; O-苷、C-苷. (2) 游离体 四、黄酮类化合物的生物活性 1、对心血管系统的作用 2、抗肝脏毒作用 3、抗炎作用 4、雌性激素样作用 5、抗菌及抗病毒作用 6、泻下作用 7、解痉作用 多媒体 讲解黄酮类化合物的理化性质及显色反应 一、性状 1、形态 黄酮类化合物大多数为结晶性固体,具有一定的结晶形状,少数为非晶形粉末. 2、旋光性 二氢黄酮(醇)、二氢异黄酮、黄烷醇具有旋光性,其它黄酮类不具有旋光. 黄酮苷由于结构中引入糖基具有旋光性,为左旋. 3、颜色 黄酮类化合物多呈黄色,所呈现的颜色与分子中是否存在交叉共轭体系及助色团(如—OH,-OCH3等)的数目多少和取代的位置有关,如果4'或7位上引入供电子基,如-OH,-OCH3等,因形成p-π共轭,具有共轭作用,促进电子转移,重排使化合物的颜色加深.但在其它位置上引入—OH,-OCH3时影响较小,如果C2-C3间的双键被氢化,则交叉共轭体系中断,故二氢黄酮和二氢黄酮醇几乎无色,异黄酮共轭很少,即显微黄色.花色素所显的颜色,随pH不同而改变,一般pH<7显红色,pH8.5紫色,pH>8.5显蓝色.pH不同可能促进结构产生可逆变化. 花青素: 二、溶解性 游离黄酮:难溶于或不溶于水,以溶于甲醇、乙醇、醋酸乙酯、乙醚等有机溶剂及稀碱液中.(黄酮、黄酮醇、查尔酮) 原因:因它们的分子中存在着交叉共轭体系,所以是一些平面型化合物,平面型分子堆砌得较紧密,分子间的引力较大,故很难溶于水.二氢黄酮和二氢黄酮醇由于分子中吡喃环已被氢化,称为近似于半椅式结构,破坏了分子的平面型,使分子排列不紧密,分子间引力降低,有利于水分子的进入,因而在水中溶解度比平面型分子稍大. 异黄酮类化合物由于B环受吡喃环羰基的立体阻碍,也不是平面分子,故亲水性比平面型分子增加. 花色素类虽然属于平面型结构,但因以离子形式存在,具有盐的通性,故水溶性较大.游离黄酮苷元中引入的取代基的种类和数目不同,对溶解度影响也不同. 引入OH:水溶性增加,脂溶性降低.引入OCH3或异戊烯基:脂溶性增加,水溶性降低. 黄酮苷以溶于热水,甲醇,乙醇,吡啶醋酸乙酯,稀碱液中,难溶或不溶于低极性有机溶剂. 三、酸性与碱性 (一)酸性 黄酮类化合物因分子中具有酚-OH,故显酸性,可溶于碱性水溶液、吡啶中,其酸性强弱与酚-OH数目的多少和位置有关,黄酮的酚-OH酸性由强到弱顺序是: 7,4'-二OH>7或4'-OH>一般酚-OH>5-OH (二)碱性 黄酮类化合物分子中γ-吡喃环上的一位氧原子,因有未共用电子对,故表现出微弱的碱性,可与强无机酸生成盐,生成的盐不稳定,加水后即可分解.黄酮类化合物溶于浓硫酸生成的洋盐,常常表现出特殊的颜色,可用于鉴别. 四、显色反应 黄酮类化合物的颜色反应多与分子中的酚-OH及γ-吡喃酮环有关: 类别 黄酮 黄酮醇 二氢黄酮 查耳酮 异黄酮 橙酮 盐酸-镁粉 黄→红红→紫红 红、紫、蓝———盐酸-锌粉 红 紫红 紫红 — — — 硼氢化钠 — — 蓝→紫红 — — — 硼酸-柠檬酸 绿黄 绿黄 — 黄——醋酸镁 黄黄蓝黄黄—三氯化铝 黄 黄绿 蓝绿 黄黄淡黄 氢氧化钠水溶液 黄 深黄 黄→橙(冷) 深红→紫(热) 橙→红黄红→紫红 浓硫酸 黄→橙黄→橙橙→紫橙、紫黄红、洋红 (一)还原试验 1、HCl-Mg(Zn)粉反应:是检查中药中是否有黄酮类化 合物的最常用的方法. 操作:在样品的乙醇或甲醇溶液中加入少许镁粉振摇,再滴加几滴浓盐酸(必要时在水浴上加热). 结果:黄酮(醇),二氢黄酮(醇)——橙红~紫红色B环上有-OH,或OCH3取代时颜色加深;查耳酮、橙酮、儿茶素、异黄酮——不显色. 2、NaBH4反应:是对二氢黄酮类专属性较高的还原剂,与 二氢黄酮反应,还原生成红~紫红色的物质,其他黄酮类均为负反应,故可用于和其他黄酮类区别. (二)金属盐类试剂的络合反应 黄酮类化合物分子中若具有3-OH、4-酮基或邻二酚-OH,可与铝盐,锆盐、镁盐、铅盐反应,生成有色络合物. 铝盐 试剂:1%AlCl3的甲醇溶液,生成的络合物为黄色,并在415nm有荧光,可用于定性及定量. 铅盐 醋酸铅可与具有邻二酚-OH、3-OH ,4-酮基或5-OH, 4-酮基的黄酮类化合物产生沉淀. 碱式醋酸铅与一般酚类化合物均可产生沉淀.据此不仅可用于鉴定,也可用于提取分离工作. 3、锆盐 2%ZrOCl2的甲醇溶液,可以用来区别黄酮类化合物分子中3或5-OH的存在,加2%ZrOCl2的甲醇溶液到样品的甲醇溶液中,若出现黄色,说明有3-OH或5-OH与锆盐生成络合物,再加入2%枸橼酸的甲醇溶液黄色不褪示有3-OH,如果黄色减退,加水稀释后转为无色,示无3-OH,但有5-OH.因为5-OH 4-酮基与锆盐生成的络合物稳定性没有3-OH,4-酮基锆络合物稳定,容易被弱酸分解. 4、镁盐 1%醋酸镁甲醇溶液,可在纸上反应.样品点于滤纸上,喷1%醋酸镁甲醇溶液,加热干燥后在紫外灯下观察: 二氢黄酮、二氢黄酮醇——天蓝色荧光 黄酮(醇)、异黄酮——黄~橙黄~褐色 5、氨性氯化锶反应 专门检查邻二酚-OH生成绿~棕色乃至黑色沉淀. FeCl3反应 常用的酚类显色剂.多数黄酮类化合物因分子中含有酚羟基,故可产生阳性反应,但一般仅在含有氢键缔合的酚羟基时,才呈现明显的颜色. (三)硼酸显色反应 5-OH黄酮及2-OH查耳酮,在无机酸或有机酸存在的条件下,与硼酸反应生成亮黄色. (四)碱性试剂显色反应 1、二氢黄酮类在碱液中开环——生成查耳酮类 2、黄酮醇在碱液中——黄色+空气——棕色可与黄酮类区别. 3、黄酮类化合物具有邻二酚羟基及3,4'-二OH在碱液中易氧化—黄色变成深红色—绿棕色沉淀.根据这些颜色变化,可以粗略地提示属于哪类化合物. 思考题: 比较下列化合物的酸性大小,并说明理由. A B C 2、比较下列化合物极性大小,如以硅胶作为固定相,正丁醇-醋酸-水(4:1:5)上层为展开剂,说明这几个化合物在薄层色谱中的Rf值大小顺序. A B C 3、鉴别下列化合物 (1) A B C (2) A B C 教法设计: PowerPoint 加板书 教学时数:第二节讲2个学时 天然药物化学课程教案 课次 2 授课方式 (请打√) 理论课 讨论课 实验课 习题课 其他 课时 安排 3 授课题目: 黄酮类化合物 第三节 黄酮类化合物的提取与分离 黄酮类化合物的检识与结构鉴定 教学目的和要求: 1、掌握黄酮类化合物提取常用的方法. 2、掌握黄酮类化合物分离常用的方法. 3、掌握紫外及可见光谱在黄酮类化合物鉴定中的应用. 4、熟悉色谱法在黄酮类化合物鉴定中的应用. 5、熟悉黄酮类化合物用聚酰胺柱色谱分离时的洗脱规律. 教学重点及难点: 重点: 1、黄酮类化合物提取常用的方法. 2、黄酮类化合物分离常用的方法. 3、紫外及可见光谱在黄酮类化合物鉴定中的应用. 难点: 1、紫外及可见光谱在黄酮类化合物鉴定中的应用. 2、黄酮类化合物用聚酰胺柱色谱分离时的洗脱规律. 教学基本内容方法及手段 黄酮类化合物的提取与分离 一、提取 黄酮类化合物在花、叶、果等组织中,一般多以苷的形式存在,而在木部坚硬组织中,则多为游离苷元形式存在. 黄酮苷类以及极性稍大的苷元(如羟基黄酮、双黄酮、橙酮、查耳酮等),一般可用丙酮、醋酸乙酯、乙醇、水或某些极性较大的混合溶剂进行提取.其中用得最多的是甲醇-水(1:1)或甲醇. 一些多糖苷类则可以用沸水提取.花青素类可加入少量酸(如0.1%盐酸).但提取一般黄酮苷类成分时,则应当慎用,以免发生水解反应.为了避免在提取过程中黄酮苷类发生水解,也常按一般提取苷的方法事先破坏酶的活性. 大多数黄酮苷元宜用极性较小的溶剂,如用氯仿、乙醚、醋酸乙酯等提取,而对多甲氧基黄酮的游离苷元,甚至可用苯进行提取. (一)溶剂萃取法 原理:利用黄酮类化合物与混入的杂质极性不同,选用不同溶剂进行萃取可达到精制纯化的目的. 例如:(1)植物叶子的醇浸液,可用石油醚处理,以便除去叶绿素、胡萝卜素等脂溶性色素. (2)某些提取物的水溶液经浓缩后则可加入多倍量 浓醇,以除去蛋白质、多糖类等水溶性杂质. 有时溶剂萃取过程也可以用逆流分配法连续进行.常用的溶剂系统有水-醋酸乙酯、正丁醇-石油醚等. 溶剂萃取过程在除去杂质的同时,往往还可以收到分离苷和苷元或极性苷元与非极性苷元的效果. (二)碱提取酸沉淀法 原理:黄酮苷易溶于碱性水、难溶于酸性水,故可以用碱性水提取,在将碱水提取液调成酸性,黄酮苷类即可沉淀出来. 此法简便易行,工厂大量生产时液采用此法.在用碱酸法进行提取纯化时,应当注意所用碱液浓度不宜过高,以免在强碱性下,尤其加热时破坏黄酮母核,在加酸酸化时,酸性液不宜过强,以免生成洋盐,致使析出的黄酮类化合物又重新溶解,降低产品收率.当药材中含有大量果胶、粘液质等水溶性多糖成分时,宜用石灰乳或石灰水代替其它碱性水溶液进行提取,使含有羧基的杂质生成钙盐沉淀,不被溶出. (三)碳粉吸附法 适用范围:苷类的精制工作. 操作:甲醇提取液中,分次加入活性炭,直至上清液的黄酮反应为阴性.收集吸附黄酮苷的碳末,依次用沸水、沸甲醇、7%酚-水、15%酚-醇溶液洗脱.大部分黄酮苷在7%酚-水洗下减压浓缩、乙醚振荡除去残留的酚.水层减压浓缩精制黄酮苷. 二、分离 (一)柱色谱法 常用的吸附剂或载体:硅胶,聚酰胺,纤维素粉,氧化铝,氧化镁,硅藻土. 1、硅胶柱色谱 主要适于分离异黄酮,二氢黄酮,二氢黄酮醇,高度甲基化的黄酮及黄酮醇类. 2、聚酰胺柱色谱 聚酰胺是分离黄酮类化合物的首选吸附剂,因为聚酰胺吸附容量大,分离效果好.其吸附强弱主要取决于黄酮类化合物分子中羟基的数目与位置一溶剂与黄酮类化合物或聚酰胺之间形成氢键缔合能力的大小. 适用范围:黄酮苷,苷元,查尔酮,二氢黄酮. 黄酮类化合物从聚酰胺柱上洗脱时规律(先→后): (1)苷元相同:叁糖苷-双糖苷-单糖苷-苷元 (2)母核上增加羟基,洗脱速度相应减慢. 羟基位置对吸附也有影响:邻位羟基黄酮-对位(间位)羟基黄酮. (3)不同类型黄酮:异黄酮-二氢黄酮醇-黄酮-黄酮醇 (4)芳香核、共轭双键多者易被吸附:二氢黄酮-查尔酮 3、葡聚糖凝胶(Sephadex gel)柱色谱 常用的型号:Sephadex G和Sephadex LH-20 原理:分离游离黄酮时,主要靠吸附作用.凝胶对黄酮类化合物的吸附程度取决于游离酚-OH的数目,分离黄酮苷时,则分子筛的性质起主导作用.在洗脱时,黄酮苷类大体上按分子量的大小洗下来. 举例说明: 化合物 取代图式 Ve/Vo 芹菜素 5.7.4-三OH 5.3 木犀草素 5.7.3'.4'-四OH 6.3 槲皮素 3.5.7.3'.4'-五OH 8.3 杨梅素 3.5.7.3'.4'.5'.-六OH 9.2 山奈酚-3-半乳糖 鼠李糖-7-鼠李糖苷 三糖苷 3.3 槲皮素-3-芳香糖苷 双糖苷 4.0 槲皮素-3-鼠李糖苷 单糖苷 4.7 常用的洗脱剂: (1)碱性水溶液(0.1mol/L NH4OH),含盐水溶液(0.5mol/L NaCl) (2)醇及含水醇如甲醇、甲醇-水(不同比例)、t-丁醇-甲醇(3:1)、乙醇等. (3)其它溶剂,如含水丙酮、甲醇-氯仿等. (二)梯度PH萃取法 适用范围:分离酸性强弱不同的黄酮苷元. 操作:将混合物溶于有机溶剂后,依次用5%NaHCO3、5% Na2CO3、0.2%NaOH及4%NaOH溶液萃取. 酸性:7,4'-OH > 7-或4'-OH>一般酚OH >5-OH 溶于NaHCO3中 溶于Na2CO3 溶于不同浓度的NaOH (三)根据分子中某些特定官能团进行分离 具有邻二酚-OH的可与醋酸铅产生沉淀.不具有邻二酚-OH的可被碱式醋酸铅沉淀.也可以利用硼酸络合法.具有邻二酚-OH的黄酮类化合物可与硼酸络合,生成易溶于水.借此可与无邻二酚-OH的黄酮类化合物相互分离. (四)其他方法 近年来,黄酮类化合物的分离也应用HPLC法. 多媒体 讲解黄酮类化合物的检识及结构鉴定 黄酮类化合物的鉴别与结构测定现在多依赖于波谱学的综合解析.未知黄酮类化合物的鉴定.多在测定分子式的基础上.利用PC或TLC得到的Rf值与文献比较.或分析对比样品在甲醇溶液中加入各种渗透试剂后得到的紫外及可见光谱进行剖析.同时,对于化合物的颜色反应,以及在提取分离中所表现的行为.(如溶解度,酸或碱中的溶解情况,铅盐沉淀等)也应注意分析. 近年来由于仪器分辨率的不断改进,1H-NMR、13C-NMR、FD-MS、FAB-MS已成为黄酮类化合物结构鉴定的重要手段. 一、色谱法在黄酮类化合物鉴别中的应用 (一)纸色谱(PC) 适用范围:分离各种天然黄酮类化合物及其苷类的混合物. 双相色谱:第一向:醇性溶剂:正丁醇:醋酸:水(4:1:5),(根据分配原理) (上层);水饱和正丁醇 第二向:水性溶剂:2-6%醋酸,3%氯化钠(根据吸附原理)醋酸-浓盐酸-水(30:3:10) 黄酮苷元:醇性溶剂:苯-醋酸-水(125:72:3) 氯仿-醋酸-水(13:6:1) 苯酚-水(4;1) 花色苷及苷元:含HCl或HOAc的溶液 显色: ①用紫外灯检查,以氨蒸气处理后观察颜色的变化. ②喷2%AlCl3/CH3OH——紫外灯下观察 ③1%FeCl3-1%K3Fe(CN)6(1:1)水溶液. 结构与Rf值的关系: 黄酮、黄酮醇、查尔酮: 在水性溶液中(3-5%HoAc)(平面型分子)Rf < 0.02—几乎停留在原点. 二氢黄酮(醇), 二氢查尔酮: 在水性溶剂中Rf 0.10-0.30 (非平面型分子,亲水性较强) 在醇性溶剂中同一类型苷元的Rf值为:苷元>单糖苷>双糖苷 BAW中展开:苷元Rf>0.70 ,苷<0.70 ;在水性溶剂中相反. (二)硅胶薄层色谱(TLC) 适用范围:分离和鉴定弱极性黄酮类化合物. 分离黄酮苷元的展开剂:甲苯-甲酸甲酯-甲酸(5:4:1) 根据待分离成分极性大小适当调整甲苯与甲酸的比例. (三)聚酰胺薄层色谱 适用范围:分离含游离酚羟基的黄酮及其苷类,因聚酰胺对黄酮类化合物的吸附能力强,故选择极性较强的展开剂: 乙醇:水(3:2) 水:乙醇:乙酰丙酮(4:2:1) 水:乙醇:甲酸:乙酰丙酮(5:1.5:1:0.5) 水饱和正丁醇:醋酸(100:2) 丙酮:水(1:1) 二、紫外及可见光谱在黄酮类鉴定中的应用 程序: 1、测定样品在甲醇溶液中的UV及可见光谱. 2、测定样品在甲醇溶液中加入各种诊断试剂后得到的UV及可见光谱. 3、各种UV光谱对比,可推测黄酮类化合物的结构类型及羟基位置. * 苷类可先水解或进行甲基化后再水解,测定苷元或衍生物的UV光谱. 诊断试剂: 向黄酮类化合物的甲醇(或乙醇)溶液中分别加入甲醇钠、乙酸钠、乙酸钠-硼酸、三氯化铝或三氯化铝-盐酸试剂能使黄酮的酚羟基离解或形成络合物等,导致光谱发生变化.据此变化可以判断各类化合物的结构,这些试剂对结构具有诊断意义,称为诊断试剂. (一)黄酮类化合物在甲醇溶液中的UV光谱 黄酮和黄酮醇等多数黄酮类在200-400nm区域内存在两个主要的紫外吸收带. 苯甲酰基 峰带II 桂皮酰基 峰带I 220-280nm (组成交叉共轭体系) 300-400nm 表5-1 黄酮类化合物UV吸收范围(nm) 带II 带I 黄酮 250—280 310—350 黄酮醇(3-OH取代) (3-OH游离) 250—280 250—280 330—360 350—385 异黄酮 245—275 310—330(sh) 二氢黄酮(醇) 275—295 300—330(sh) 查耳酮 230—270(低强) 340—390 橙酮 230—270(低强) 380—430 花色素及其苷 270—280 465—560 取代基及其位置对黄酮化合物的影响: 无论A环、B环,增加羟基数目均使相应谱带红移. 羟基甲基化及糖苷化使相应谱带紫移. 羟基乙酰化使原羟基的影响消失. 1、黄酮及黄酮醇类 两者的UV光谱相似,但带I位置不同.黄酮带I 310-350nm;黄酮醇带I 350-385nm.黄酮、黄酮醇母核上,7-及4'-引入-OH,-OCH3等供电基,相应吸收带向红位移. 化合物 带I (λmaxMeOH, nm) 3,5,7-三羟基黄酮(高良姜素) 359 3,5,7,4'-四羟基黄酮(山柰酚) 367 3,5,7,3',4'-五羟基黄酮(槲皮素) 370 3,5,7,3',4' ,5 '-六羟基黄酮(杨梅素) 374 带II的峰位主要受A环氧取代程度的影响,A环上的含氧取代基增加时,带II向红位移,而对带I无影响,或影响甚微. 2、查耳酮及橙酮类 特征:带I很强为主峰,带Ⅱ比较弱,为次强峰. 查耳酮:带II位于220-270nm 带I位于340-390nm 橙酮:带I位于370-430nm 带II位于388-413nm——天然橙酮 3、异黄酮、二氢黄酮及二氢黄酮醇 因B环不与吡喃酮环上的羰基共轭,故带I很弱,常在主峰的长波方向处有一肩峰.异黄酮主峰在245-270nm;二氢黄酮(醇)主峰在270-295nm. (二)加入诊断试剂后引起的位移及其在结构测定中的意义 当向黄酮类化合物的甲醇溶液中分别加入诊断试剂NaOMe,NaOAc,NaOAc-H3BO3,AlCl3或AlCl3-HCl时,由于诊断试剂黄酮类化合物母核上的酚羟基产生不同程度的解离或与黄酮类化合物生成络合物等,导致UV光谱发生变化,据此变化以判断黄酮类化合物的结构. 1、NaOMe 甲醇钠碱性较强,可使黄酮类化合物母核上所有酚羟基解离,导致相应吸收带向红位移. ①如带I位移40-60nm,强度不变或增强,则示有4'-OH. ②如带I红移50-60nm,强度减弱,则示有3-OH,但无4'-OH. ③7-OH游离:320-330nm有吸收,成苷:该吸收消失. ④含有3,4'-OH,或3,3',4'-OH,5,6,7或5,7,8或5,3',4'-OH的黄酮,在甲醇钠碱性氧化分解,吸收带随测定时间延长而衰退. 2、NaOAc 醋酸钠的碱性比甲醇钠小,只能是黄酮类化合物母核上酸性较强的酚羟基解离. ①7-OH:带II向红位移5-20nm. ②4'-OH:带I红移40-65nm,强度下降 ③对碱敏感的基团——吸收谱图随时间延长而衰退. 3、NaOAc-HBO3 黄酮或黄酮醇类化合物的A环或B环上如果具有邻二酚羟基时,在NaOAc碱性下可与 H3BO4络合,使相应吸收带向红位移,B环有邻二酚羟基时,带I向红位移12-30nm,A环有邻二酚羟基带II向红位移5-10nm. 黄酮类化合物与硼酸形成的络合物 4、AlCl3及AlCl3/HCl AlCl3可与具有3-OH,4-羰基或5-OH,4-羰基的黄酮醇类化合物作用生成络合物,使带I或带II向红位移,AlCl3也能与A环或B环上的邻二酚羟基作用生成络合物,使相应的吸收带向红位移,但所形成的络合物不稳定,当加入HCl后即可分解,使相应的吸收带向紫位移. ①AlCl3/HCl谱图=AlCl3谱图,示结构中无邻二酚羟基. ②AlCl3/HCl谱图≠AlCl3谱图,示结构中有邻二酚羟基. 带I紫移30-40nm,示B环可能有邻二酚羟基. 带I紫移50-60nm,示A、B环均可能有邻二酚羟基. 带I紫移20nm,示有邻三酚羟基. ③ AlCl3/HCl谱图=MeOH谱图,示无3-及/或5-OH. ④ AlCl3/HCl谱图≠MeOH谱图,示有3-及/或5-OH. 带I红移35-55nm,示只有5-OH. 带I红移60nm,示只有3-OH. 红移50-60nm ,示可能同时有有3-及5-OH. 红移17-20nm ,示除有5-OH外尚有6-含氧取代. 黄酮类化合物与AlCl3形成的络合物 注:测定时多选用甲醇作UV光谱测定的溶剂,如果以乙醇作测定溶剂,其中含有的痕迹量水分可以抑制AlCl3与邻二酚羟基形成络合物. 以上所述为一般经验规律.实践中常需要结合化学方法及其它光谱法综合分析.如邻二酚羟基可用氨性氯化锶反应来加以识别.3或5-OH可用锆-枸橼酸反应识别. 思考题: 1、黄酮类化合物的提取分离方法有哪些?原理是什么? 2、某中药材中含有如下成分:①多糖 ②芦丁 ③槲皮素,若采用下列流程进行分离,请将各成分填入括号内. 多媒体 讲解