结果与讨论
豆科黄矮病毒衍生载体表现系统大量且等量表现目标蛋白质 将不同的质体组合,共转形至菸草叶.感染五天后结果显示,BYGFP /REP110/p19,BYDsRed/REP110/p19 和 BYGFP/BYDsRed/REP110/p19 的处组 中,可观察到明显的萤光表现;取其感染后的叶肉原生质体观察,其中 BYGFP/BYDsRed/REP110/p19 共感染的原生质体在同一细胞中可同时表现绿色 和红色萤光,显示质体间不会互相竞争生产蛋白质.抽取全量 DNA 进 DNA 电泳和 southern blot analysis,结果显示共转形 Rep/Rep A protien 和 p19 可帮助提
高报导基因复制(copy number);以 southern blot 分析,比较共转形绿色(GFP) 及红色(DsRed)报导基因至同一宿主个体,和分别表现於不同个体间的基因复制 数,没有显著差异.显示将绿色和红色萤光蛋白质可在同一细胞中大量且等量表 现,彼此之间不会相互竞争,因此可以应用在多次单元体蛋白质的生产. 单一载体系统之开发 本研究尝试将报导基因 GFP,DsRed 和 Rep/RepA 建构在单一质体 (BYGFPDsRed.R),结果显示 BYGFPDsRed.R 转形株萤光蛋白质基因复制数和 多个质体共转形结果相当,相较於上述实验操作为简便快速;随后将报导基因 置换为伊波拉病毒单株抗体的 heavy chain 和 light chain 基因 结果显示单一载体 , 表现两个目标基因(pBY-HL (6D8).R)与将目标基因分别建构在不同载体进共 转形(pBY-H(6D8)/pBY-L(6D8)/Rep110)的单株抗体表现量十分接近.因此作者认 为,利用单一载体转形即可促进并提高目标蛋白质的快速产生,而操作简便可 提高其实际应用性. 功能性蛋白质伊波拉病毒单株抗体的表现,组装和正确功能性 本研究利用 pBY-HL(6D8).R 和 pBY-H(6D8)/pBY-L(6D8)/Rep110 在菸草叶 中表现,农杆菌感染二至八天后,以粗萃法取得 total soluble protein,以 ELISA 定量,结果显示两处组单株抗体的表现量没有明显差异.接著以 SDS-PAGE 和 western blot 确认蛋白质分子量,单株抗体 heavy chain 和 light chain 大小分别 为 50 KDa 和 25 KDa;但以 native PAGE 上单株抗体大小为 170 KDa,显示单株 抗体已组装成四聚体形式.接著利用硫酸铵沉淀法和亲和性层析法纯化去除杂蛋 白,最后利用纯化后的单株抗体和减毒后的伊波拉病毒以 ELISA 分析专一性结 合功能,结果显示单株抗体浓度越高其吸光值也随之增加,显示以菸草生产的伊 波拉病毒单株抗体具有正确的功能,可以和伊波拉病毒专一性的结合.
参考文献
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