442
Journal of Chinese Physician ,April ,2004 ,Vol 6 ,No4
胃癌组织及癌旁组织蛋白质双向电泳图谱的差异分析
陈彦 ,贺修胜ΞΞ ,容映晖 ,罗桥 ,宋颖 ,龙志峰 ,苏坚 ,李艳兰
( 南华大学肿瘤研究所 ,湖南 衡阳 421001)
2000 ,78 :210 - 221
【摘要】 目的 利用蛋白质组学方法建立分辨率高和重复性好的人胃癌组织及其正常胃黏膜组织的双向凝胶电泳图谱 ,分析 其差异表达的蛋白质 ,为进一步寻找胃癌标志物奠定基础 .方法 采用固相 pH 梯度双向凝胶电泳分离人胃癌组织及正常胃黏膜 组织的总蛋白质 ,凝胶经银染显色后 ,Imaging Master 2D 图像分析软件进行比较分析 ,识别差异表达的蛋白质 .结果 ⑴ 癌组织和正 常胃黏膜组织凝胶的平均蛋白质点数分别为 1049 ± 和 1097 ±73 , 平均匹配的点数分别为 835 ±48 和 953 ±56 , 匹配率分别为 67
7916 %和 8617 % . ⑵ 通过比较分析 5 例胃癌组织及正常胃黏膜组织的双向凝胶电泳图谱 ,得到平均匹配蛋白点数为 769 ± ,差异 45
表达蛋白点数为 81 个 ,其中 17 个点仅在癌组织中表达 ,24 个点仅在正常胃黏膜中表达 ,26 个点在癌组织中为高表达 ,14 个点在癌 组织中为低表达 .结论 本研究建立了分辨率高且重复性较好的人胃癌组织与正常胃黏膜组织的双向凝胶电泳图谱 ,发现两者间 存在一些差异表达的蛋白质 ,为进一步筛选胃腺癌特异性的分子标志物打下了坚实的基础 .
[ 关键词 ] 胃癌 ; 双向凝胶电泳 ; 蛋白质组
Differential Analysis of Two - dimensional Gel Electrophoresis Profiles of G astric Carcinoma and Paired Normal G astric Mucosa
CHEN Yan , HE Xiu - sheng , RONG Ying - hui , et al . Cancer Research Institute of Nanhua University , Hengyan 421001 , China
【Abstract】 Objective To establish two - dimensional electrophoresis profiles with high resolution and reproducibility from human gastric
carcinoma and paired normal gastric mucosa tissues and to analyse the differential expression proteins between the two types of the tissues. Methods
ware. Results ⑴ Average protein spots were 1049 ± , 1097 ± in gastric carcinoma and paired normal gastric mucosa respectively ,the matched 67 73 total of 769 ± protein spots were matched between the electrophoretic maps of 5 gastric carcinoma and paired normal gastric mucosa tissues. The 81 45 differential protein spots were identified between the two types of the tissues. 17 protein spots were expressed only in the gastric carcinoma and 24 protein spots were expressed only in the normal gastric mucosa. The expression levels of 26 protein spots in the gastric carcinoma were higher than those in the normal gastric mucosa , and the expression levels of 14 protein spots in the gastric carcinoma were lower than those in the normal gastric mucosa. Conclusion In this study , the well - resolved ,reproducible 2 - DE patterns of gastric carcinoma and paired normal gastric mucosa tissues biomarkers of gastric carcinoma. were established and some differential proteins between the two types of tissues were found. These data will be helpful to further screen specific spots were 835 ± , 953 ± in both the two types of tissues respectively , and the average matching rate was 79 6 % , 8617 % respectively. ⑵ 48 56 1 A
4 Gehring W , Affolter M , Burglin T , et al . Homeodomain proteins[J ] . Annu J Rev Biochem ,1994 ,63 :487 - 526 5 Scott MP. Vertebrate homeobox gene nomenclature[J ]1Cell ,1992 ,71 :551 - 553 tive neuroectodermal tumors[J ] . Anticancer Res ,2000 ,20 :1769 - 1780
6 Bodey B , bodey BJ , Siegel SE , et al . Immunocytochemical detection of the
7 Bostrom K, Tintnt Y, Kao SC , et al , HOXB7 overexpression promotes dif2
sional gel electrophoresis (2 - DE) . After silver staining , the differential expression proteins were analyzed by using Imaging Master 2D analysis soft 2
亡率高居各类恶性肿瘤之首 , 严重威胁着人们的健康 和生命 .在胃癌发病分子机理的研究方面 , 虽从基因 (DNA) 和基因转录 ( mRNA) 水平进行了大量的研究[1 ] . 然而基因的功能是通过其表达的蛋白质来实现的 , 若
The total proteins of gastric carcinoma and paired normal gastric mucosa tissues were seperated by immobilized pH gradient - based two - dimen 2 【 Key words】 Gastric carcinoma ; Two - dimensional electrophoresis , 2 - DE ; Proteome
胃癌属常见恶性肿瘤之一 , 在我国其发病率及死
能直接从蛋白质水平入手来研究胃癌 ,将能更加全面 , 真实地揭示胃癌癌变过程中的分子事件 .随着蛋白质 组学的问世及其相关技术的不断发展与完善 , 肿瘤蛋 白质组学研究已成为当今肿瘤研究的热点课题[2 ] . 本研究应用固相 pH 梯度双向凝胶电泳技术分离
ferentiation of C3H10T1/ 2 cells to smooth muscle cells[J ] . J cell Biochem ,
Ξ
Ξ 基金项目 : 湖南省教育厅课题基金资助项目 (018016 ,97B095) ; 湖南省卫生厅课题基金资助项目 ( Y02 - 069) ΞΞ 通讯作者 :0734 - 8281075 ,Email :hxs59 @hotmail . com Tel
homeobox B3 ,B4 ,AND C6 gene products in childhood medulloblastmas/ promi2
8 Fuller J F , Achdara J , Yaron Y, et al . Characterization of HOX gene expres2 tion[J ] . Blood ,1999 ,93 :3391 - 3400 sion during myelopoiesis role of HOXA5 in lineage commitment and matura2
[ 收稿日期 :2002 - 12 - 04 ]
中国医师杂志 2004 年 4 月 6 卷第 4 期 第
443
人胃癌组织及正常胃黏膜组织的总蛋白质 , 建立双向 凝胶电泳图谱 , 采用 Imaging Master 2D 图像分析软件 进行比较分析 ,识别差异表达的蛋白质 ,以期为寻找与 人胃腺癌发病相关的蛋白质奠定基础 . 1 材料和方法
1· 材料 1·· 1 1 标本 例胃癌样本 , 胃癌组织及配对的正常 5 胃黏膜组织 ( 距癌组织 > 10cm 远端的胃黏膜 ) 取自本
校附一医院手术切除胃癌标本 ( 2002 - 03 - 04) , 所有 标本均经病理确诊 ,5 例胃癌均为高分化腺癌 . 1· · 试剂 硫脲 , 1 2 二硫苏糖醇 ( DTT) , 碘乙酰胺 ( Sigma 公司产品 ) ; 固相 pH 梯度干胶条 ( IPGstrip pH3 - 10 L ,24 cm) , 覆盖液 , 蛋白银染试剂盒 , 尿素 , 丙烯 酰胺 , 叉 双 丙 烯 酰 胺 , 氨 酸 , , 甲 甘 Tris CHAPS , SDS (Amersham Biosciences 公司产品) .
1·· 1 3 仪器 IPG phor 等电聚焦仪 , Imaging Master 2D Elite 4101 凝胶图像分析软件 , Ettan Dalt Ⅱ 垂直电泳仪
为 Amersham Biosciences 公司产品 . 1· 2 方法 1·· 2 1 组织标本的处理 无菌条件下切取手术后新 鲜的胃癌组织及距肿瘤 > 10cm 的正常胃黏膜组织 ,用 生理盐水反复清洗组织 ,以去除血液 ,尽可能剪去其他 组织 ,处理后的样品立即用于蛋白质的抽提或置于 80 ℃ 保存备用 . 1· · 2 2 组织总蛋白质的制备 Araki 等的方法进 按 行 [3 ] . 1·· 2 3 固相 pH 梯度双向凝胶电泳 G 等的方 按 org 法进行 [4 ] . 1·· 2 4 凝胶图像分析 凝胶通过 Imagescanner 扫描仪 以及 LabScan 扫描软件进行扫描获取图像 ,利用 Imag2 同一标本的总蛋白质 , 选择上样量为 0175mg , 进 行 3 次重复检测 .发现 3 次双向电泳图谱非常相似 , 采用 Imagescanner 扫 描 仪 扫 描 获 取 图 像 , 然 后 通 过 Imaging Master 2D Elite 4101 分析软件进行点分析 , 获 得胃腺癌组织及对应正常胃黏膜组织 3 块凝胶的平均 蛋白质点数分别为 1049 ± 和 1097 ± .这些蛋白 67 73 质等电点和分子量分布范围较广 ,但大多数集中于 pH 值 4 - 8 ,分子量 14 - 116kD 区域 . 经过背景消减后 ,将 其中的一块胶定为参考胶进行 3 块胶间的蛋白质点的
Master 2D Elite 4101 分析软件对图像进行强度校正 , 点
检测 , 背景消减 , , 校正 , 匹配 1D 建立平均凝胶分析等 . 斑点位置的重复性按 Corbett 的方法[5 ] 进行计算 .所 有数据的统计分析在 SPSS 1010 软件和 Excel 上进行 . 2 结果
匹配 ,胃腺癌组织及配对的正常胃黏膜组织平均匹配 的点数分别为 835 ± 和 953 ± ,匹配率达 7916 %和 48 56 8617 % .再任意选取同一癌组织的 3 块胶中相互匹 配且分辨清晰的 50 个蛋白质点 ,选择位置偏中间的一 个点为原点 ,以参考胶为参考位置 ,测量出其它两块胶
1253 个 ,将建立的平均凝胶进行匹配用于两组图谱的
差异表达分析 . 3 讨论 随着人类大规模草图测序工作的完成 , 标志着以 蛋白质学研究为主要研究内容之一的后基因组时代的
对应点在第一向 IEF 及第二向 SDS - PAGE 方向上位 置的偏差 .发现 3 块胶的蛋白质点在位置上有较好的 重复 性 , 不 同 胶 间 蛋 白 质 点 在 IEF 方 向 的 偏 差 为 (01873 ±01125 ) mm , 在 SDS - PAGE 方向上的偏差为 ( 11025 ± 1213) mm , 因此获得了重复性较好的人胃腺 0 谱较相似 , 利用 Imaging Master 2D Elite 4101 分析软件 对其进行分析匹配 ,从而建立了 5 块胶的平均凝胶图 , 点检测共有蛋白质点 1342 个 .用相同的方法对 5 例 配对的正常胃黏膜组织双向凝胶电泳图谱进行软件分 析 ,亦 建 立 起 其 平 均 凝 胶 图 , 点 检 测 共 有 蛋 白 质 点 异的疾病生物标志物 . 为了更真实揭示胃癌蛋白质表达谱 , 识别与鉴定 出胃癌相关的蛋白质 , 本研究采用人胃腺癌组织及配 对的正常胃黏膜组织的蛋白质表达谱进行分析 , 以期 更能准确反映胃癌蛋白质的表达状况 .考虑到组织标 本的获取过程有可能受到多方面因素如血液 , 结缔组 织等的影响 ,故在取材时应尽可能的去除间质成分 ,对 取得的标本进行清洗以去除血液 , 并尽可能地获得较
癌组织及对应正常胃黏膜组织的双向凝胶电泳图谱 (见图 1 ,2) .对两组凝胶电泳图谱进行匹配分析 , 得 到平均匹配点数为 769 ± . 45 对 5 例胃腺癌组织及其配对的正常胃黏膜组织的 蛋白质进行双向凝胶电泳 , 发现 5 例癌组织的银染图
来临及肿瘤蛋白质组学的兴起 .从蛋白质水平探索肿 瘤发生发展的分子机制 , 是当今肿瘤研究的新热点 . 研究表明 ,大量的蛋白质分子参与了肿瘤细胞周期 , 凋 [6 ] 亡及转移的调控 .而蛋白质组学将为肿瘤发病机理 研究 , 肿瘤标志物的筛选提供新的平台[7 ] .目前蛋白 质组学研究主要包括两个方面 : 一个方面是建立机体 组织或细胞的蛋白质组 2D - PAGE 参考图谱和数据 库 ; 另一个方面是通过比较生理和病理条件下 ( 如疾 病状态) 或疾病不同发展阶段蛋白质成分在表达水平 , 修饰加工以及亚细胞定位等方面的改变情况 , 从而发 现和鉴定出疾病相关的蛋白质 ( 群 ) , 进一步筛选出特
444
Journal of Chinese Physician ,April ,2004 ,Vol 6 ,No4
纯净的肿瘤细胞等 , 这样可以得到比未经上述处理更 真实反映组织蛋白质表达状况的电泳图谱 .重复性问 题也是双向凝胶电泳中的关键问题 ,在实验样品制备 , 二向电泳凝胶制备以及银染等过程中应尽可能保持一 致 ,上述条件的一致是保证结果重复性好的关键所在 . 本文利用 Imaging Master 2D 分析软件建立了人胃 腺癌组织的平均凝胶 ( 一组凝胶经统计学处理合并在 一起生成的模拟凝胶) ,所谓平均凝胶是指同种样品的 一组凝胶中最具代表性的一张凝胶 ,它包含信息更多 , 采用它来进行差异蛋白表达分析更具代表性 , 并为进 一步的质谱分析研究提供有利的条件[8 ] .本研究结果 显示 ,在胃癌组织与正常胃黏膜组织之间存在差异表
达蛋白质 ,其差异表达蛋白点数为 81 个 ,其中 17 个点 仅在癌组织中表达 ,24 个点仅在正常对照中表达 ,26 个点在癌组织为高表达 ( 表达量高于正常胃黏膜组织 的 5 倍以上) ,14 个点在癌组织为低表达 ( 表达量低于 正常胃黏膜组织的 5 倍以上 ) .通过对这些差异蛋白 质点的质谱分析鉴定 , 将有助于筛选出胃癌癌变相关 的或特异的蛋白质分子 .本项研究的蛋白质质谱鉴定 工作正在进行中 ,以期能寻找到胃癌癌变相关的或特 异的标志物 . ( 志谢 本文实验在中南大学湘雅医院卫生部肿瘤蛋 白质组重点实验室完成 ,特此致谢)
图1 胃癌组织的双向凝胶电泳图谱 带有圆圈的点表示仅在癌组织中检测到的蛋白质点 ,带有三角形的点表示在胃癌中蛋白表达量高于正常胃黏膜 5 倍以上的蛋白质点 , 带有矩形的点 表示在胃癌中蛋白表达量低于正常胃黏膜 5 倍以上的蛋白质点
图2 正常胃黏膜组织的双向凝胶电泳图谱 带有圆圈的点表示仅在正常胃黏膜组织中检测到的蛋白质点
( 下转第 492 页)
492
Journal of Chinese Physician ,April ,2004 ,Vol 6 ,No4
断, 处理髋臼骨折中价值极大 ,能较好的显示关节腔内 碎骨片 ,骨折移位和股骨头损伤等情况 ,有助于选择切 口, , 术式 内固定方式等 .CT 三维重建更有助于立体 地了解骨折情况 [4 ] . 3· 2 治疗方式和手术时机的选择 因髋臼骨折属关 节内骨折 ,其疗效的好坏取决于完整的臼顶和股骨头 - 臼的良好关系 .故治疗上要求尽可能解剖复位并予 可靠的固定 ,以利髋关节早期功能锻炼 ,减少并发症的 发生 .作者在实践中体会到凡累及臼负重弓的骨折 , 单纯骨牵引疗效都不佳 ,因髋臼骨折移位 ,月状关节面 大多有台阶 ,不光滑 , 而手术可将骨折解剖复位 , 清除 游离体 ,固定确实 ,减少卧床时间 ,早期功能锻炼 ,减少 骨性关节炎和关节僵硬的发生 .本组结果表明 , 髋臼 骨折手术指征为 ⑴ 凡经髋臼负重骨折移位 > 3mm , ⑵ 髋臼内有碎骨片 , ⑶ 后壁 , 后柱骨折 , 片呈示缺损 > CT
40 % ,尤其是髋关节后脱位者 , ⑷ 髋臼后壁骨折伴坐骨
后柱骨折, 横型或 T 型骨折 ,创伤小显露好.前侧髂腹股 沟入路适用于前柱和前壁骨折 ,该切口能够显露骨盆及髋 臼的前内侧面 ,但此切口解剖关系较复杂 ,术中应显露三 个 "窗口"第一窗为外侧窗口 ,即内侧骼窝.第二个窗口 , 是位于髂腰肌和股神经与髂血管之间的髂耻线和方形区. 第三个窗口称为内侧窗口即耻骨后间隙 ,如合并骶髂关节 骨折脱位或耻骨骨折和耻骨联合分离 ,可通过髂腹股沟切 口一次完成.对于双柱骨折伴后壁骨折等复杂型髋臼骨 折宜采用二者联合入路 ,体位采用 "懒散侧卧位" 依次或同 时进行复位, 内固定.本组 62 例中 ,选择髂腹股沟入路 13 例 ,K ocher - Langenbach 入路 31 例 ,二者联合入路 18 例 ,由 于术前诊断明确 ,没有 1 例因入路选择不当 ,暴露不充分 而影响复位固定. 另外术中对于髋臼壁的骨折块尽量不予剥离 , 尽 量不切开关节囊 ,或因骨折复位需要 ,或需清除关节内 碎骨片 ,亦仅作有限暴露关节囊 ,以最大限度保证骨折 块和股骨头的血供 ,本文 62 例病例中无 1 例发生骨折 不愈合或并发股骨头无菌坏死 .
参考文献
1 吴阶平 ,裘法祖 ,黄家驷 1 外科学 ( 第 5 版) [M] 1 北京 : 人民卫生出版
神经压迫症状 , 观察一周不见好转者 , ⑸ , 中 青年患者 骨折复位及功能恢复要求较高 , 非手术治疗失败者 . 髋臼骨折特别是复合型的髋臼骨折 , 多糸高能量 创伤所致 ,常伴有其它部位或脏器的损伤 ,应优先处理 危及生命的合并伤 ,伤肢行骨牵引制动 ,若伴有股骨头 中央型脱位而无复位条件可行股骨髁 + 股骨粗隆侧方 牵引 .一般髋臼骨折的最佳手术时间是患者全身情况 稳定后尽可能在 2 ～ 10d 内进行 [5 ] , 超过二周 , 由于血 肿机化 , 软组织的挛缩和早期骨痂形成 ,均妨碍骨折复 位的操作 ,强行复位势必造成广泛的显露 ,使异位骨化 等并发症占率增大 . 3· 3 手术入路 髋臼骨折复位质量与手术显露直接有 关 ,经术前 Jadet X 线片和 CT 片 ,可以对骨折类型有良好 认识 ,但没有一种手术入路适用于所有类型的髋臼骨折内 固定 ,一般后侧 K ocher - Langenbach 切口用于髋臼的后壁,
( 上接第 444 页)
参考文献
1 Sekido Y, Fong K , Minna JD. Progress in understanding the molecular M pathogenesis of human gastric adenocarcinoma [J ] . Biochim Biophys Acta , 1998 ,1378 (1) : 21 - 59 2 Hirano T , Fujioka K, Franzen B , et al . Relationship between TAO1 and TAO2 polypeptides associated with gastric adenocarcinoma and histocytologi2
社 ,1991 ,2252 - 2258
2 卢世壁主泽 . 坎贝尔骨科手术学 ( 第 9 版) [ M] . 济南 : 山东科学技术
出版社 ,2001 ,2181 - 2198
3 Matta JM. Operative treatment of acetabular fracture through the ilioinguinal approach[J ] . Clin Orthop ,1994 , (305) :10 - 19 [J ] . 中华骨科杂志 ,2002 ,10 :608 - 612
4 王林森 ,宋其韬 . 螺旋 CT 扫描三维多平面重建在髋臼骨折中的应用
cal features[J ] . Br J cancer , 1997 , 75 (5) : 978 - 985
3 Araki N , Morimasa T , Sakai T , et al . Comparative analysis of brain proteins
4 G A , Obermaier C , Boguth G, et al . The current state of two - dimen2 org sional electrophoresis with immobilized pH gradients [ J ] . Electrophoresis ,
from P53 - decificient mice by two - dimensional electrophoresis[J ] . Elec2 trophoresis , 2000 , 21 (9) : 1880 - 1889
5 Weber M , Berry DJ ,Harmsen WS. T otal hip arthropasty after operative treat2 ment of an acetabular fracture[J ] . J Bone Joint Surg(Am) , 1998 , 80 (9) : 1295 - 1305
[ 收稿日期 :2003 - 07 - 29 ]
2000 , 21 (6) : 1037 - 1053
5 Corbett JM , Dunn M , Posch A , et al . Positional reproducibility of protein J
6 Ong SE , Foster LJ , Mann M. Mass spectrometric - based approaches in quantitative proteomics[J ] . Methods , 2003 , 29 (2) :124 - 130 7 Petricoin EE , Paweletz CP , Liotta LA. Clinical applications of proteomics :
8 Sinha SK, Zachariah S , Quinones HI , et al . Role of TRAF3 and - 6 in the Activation of the NF - kappa B and JNK Pathways by X - linked Ectodermal Dysplasia Receptor[J ] . J Biol Chem ,2002 , 277 (47) : 44953 - 44961
lized pH gradients isoelectric focusing in the first dimension : An interlabora2 tory comparison[J ] . Electrophoresis , 1994 , 15 (8 - 9) : 1205 - 1211 proteomic pattern diagnostics[J ] . J Mammary G land Biol Neoplasia , 2002 , 7 (4) : 433 - 440
spots in two - dimensional polyacrylamide gel electrophoresis using immobi2
[ 收稿日期 :2004 - 02 - 25 ]