前言
Western Blot 是通过聚丙烯酰胺凝胶电泳将蛋白根据分子量大小分开, 然后转移到固相载体(杂交膜)上,最后通过抗原抗体反应检测杂交膜上 的靶蛋白是否存在,从而检测到靶蛋白在待测标本中的表达情况.目前 Western Blot 已经是蛋白检测的最常用和成熟的技术之一. 要成功完成 Western Blot 检测,必须满足 4 个条件: 1. 凝胶洗脱:转移期间蛋白质必须从凝胶中洗脱出来,如果蛋白质还 截留在凝胶中,将无法在膜上进行分析 2. 吸附到膜上:在转移过程中蛋白质必须吸附到膜上,如果蛋白不吸 附,将无法在膜上进行分析 3. 处理期间仍截留在膜上:在转移后的处理过程中蛋白质必须保持吸 附在印迹膜上 4. 处理过程中可接近:被吸附的蛋白质必须能够与检测试剂接触,如 果蛋白质被掩盖则无法检测 成功进行 Western Blot 检测,设置合适正确的对照是必不可少的,只 要正确设置了这些对照, 即可快速和准确的找到 Western Blot 的问题所在, 并保证实验结果的准确性和特异性!一般需要设置的对照如下:

阳性对照:明确表达检测蛋白的组织或细胞,用于检测抗体的工作 效率 阴性对照:明确不表达检测蛋白组织或细胞,用于检测抗体的特异 性 二抗对照:不加一抗,用于检测二抗的特异性 内参对照:检测标本的质量和二抗系统 空白对照:不加一抗和二抗;用于检测膜的性质和封闭的效果
本手册从按照 Western Blot 操作的基本过程来解析一些主要的要点和 注意事项,常见问题分析,旨在能为各位老师在进行实验时提供点滴参考.
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Western Blot 基本操作流程图 细胞/组织蛋白提取 蛋白定量,煮沸处理 上样,电泳
转膜
封闭 洗膜 一抗孵育 洗膜 二抗孵育 洗膜 底物孵育
曝光或者显色
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WB 第 1 步:组织或细胞蛋白提取,样本处理 一,蛋白提取
蛋白提取的质量直接决定着 WB 结果的好坏,因此,根据标本类型和 检测类型选择合适的蛋白制备方法是至关重要的! 使用适当的裂解液裂解贴壁细胞,悬浮细胞或组织样品.对于某些特 定的亚细胞组份蛋白,例如细胞核蛋白,细胞浆蛋白,线粒体蛋白等,可 以参考相关文献提取这些亚细胞组份蛋白,也可以使用商业化的试剂盒进 行抽提. 1,根据检测蛋白的位置选择合适的裂解 buffer:
蛋白位置 全细胞 胞浆(可溶性蛋白) 胞浆(骨架结合蛋白) 膜蛋白 核蛋白 线粒体蛋白 推荐 buffer NP-40 或 RIPA Tris-HCl Tris-Triton NP-40 or RIPA RIPA or 核蛋白提取试剂盒 RIPA or 线粒体分离试剂盒
线粒体/细胞浆蛋白分离试剂:该试剂盒提供独特的试剂可从多种哺乳 动物细胞(包括凋亡和非凋亡细胞)中分离出线粒体部分和胞浆部分,得 到的蛋白保持了原有的生物学活性,可直接用于分析线粒体组份在胞浆和 线粒体中分布的变化,如:WB,ELISA 等.操作过程简单,方便,不使用 有毒的物质,无需超速离心.该试剂盒也可用于分离完整的线粒体架构.
相关产品信息
目录号 产品描述 规格 价格
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Mitochondria/Cytosol Fractionation Kit
100test
4272
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2,选择合适的蛋白酶抑制剂,避免蛋白降解,从而保证检测的准确性!
抑制剂名称 作用蛋白酶/磷酸酶 名称 胰蛋白酶,糜蛋白 酶,纤溶酶 溶酶体酶 天冬氨酸蛋白酶 丝氨酸,半胱氨酸蛋 白酶 需要 Mg2+和 Mn2+ 的金属蛋白酶 需要 Ca2+的金属蛋白 酶 丝氨酸/苏氨酸磷酸酶 酪氨酸磷酸酶 终浓度 储存液 (保存在 -20℃) 用水溶解, 10 mg/ml 不可反复冻融 用水溶解.不可反复 冻融. 用甲醇溶解, 1mM. 用乙醇溶解.分装管 可反复使用. 用蒸馏水溶解 0.5M 调整 pH 值到 8.0 用蒸馏水溶解 0.5M 调整 pH 值到 8.0 用水溶解.不可反复 冻融. 用水溶解.不可反复 冻融.
Aprotinin Leupeptin Pepstatin A PMSF EDTA EGTA Na Fluoride Na Orthovanadate
2μg/ml 5-10 μg/ml 1μg/ml 1mM 5mM 1mM 5-10mM 1mM
Sodium orthovanadate 制备:用双蒸水制备100 mM的溶液;用HCl调整pH值到 9.0,然后煮沸到溶液无色,冷却到室温;再次调整pH值到9.0,再煮沸到溶液 无色. 如此反复调整煮沸直到pH值维持在9.0不再变化. 用双蒸水调整到初始体 积.分装然后保存在-20°C
注意:在煮沸过程中液体体积避免变化太大,可加瓶盖以免溶液过渡蒸发.需 在通风橱中操作.溶液变黄后即丢弃.
相关产品信息
目录号 产品描述 规格 价格
ab65621
Protease Inhibitor Cocktail (Aprotinin,Leupeptin,Pepstatin A,PMSF) 021-61130227/8/9
500test
2160
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3,在检测时使用内参抗体,以检测蛋白提取的质量 4,提取蛋白后进行蛋白的定量,以对后续操作进行监控(比如半定量,确 定蛋白上样量等) 蛋白质的快速定量方法主要依靠蛋白质本身的发色基团,或其与其它 显色剂反应产生的紫外吸收来进行定量.目前常用的主要有直接紫外吸收 法,Bradford 法和 Lorry 法三种.也有市售的商业化的蛋白定量试剂盒,可 直接购买使用.
二,样品处理(提取后蛋白处理)
1,变性,还原标本: 在标本中加入含有SDS的上样缓冲液, 然后在95-100℃煮沸5-15分钟, 以充分变性蛋白,保证蛋白从空间结构变为一级结构(多聚体解散为单聚 体,氧化状态转化为还原状态等) .有时也可以在70°C加热5-10分钟,尤其 适用于多次跨膜蛋白的检测(这些蛋白在煮沸状态下容易聚集,而聚集状 态则会影响标本进入凝胶的效率). 标准的上样缓冲液是 2X Laemmli buffer,有时为了减少标本的稀释比 例,也可以制备 4X 和 6X 的上样缓冲液.如果使用 2X 缓冲液,则缓冲液 和标本的比例为 1:1. 在加热/煮沸前后,均需要充分漩涡混匀标本. 上样量:一般为20-40ug,根据样本中待测蛋白的表达水平,做出合适 的优化.上样量过多会出现非特异性染色;过少则会导致检测不到出现假 阴性的结果.
Laemmli 2X buffer 的配方: 4% SDS 10% 2-mercaptoehtanol 20% glycerol 0.004% bromophenol blue 0.125 M Tris HCl
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调整 pH 值到 6.8
2,天然和非还原标本: 有些抗体识别的表位是非连续氨基酸,这些氨基酸虽然在蛋白质一级 结构中彼此不连续,但是在空间结构中则是靠在一起的.这些抗体就只能 识别靶蛋白的空间结构状态(一般在抗体的说明书中都会有特殊说明). 对于这类抗体检测的标本,只需要在缓冲液和凝胶中去除 SDS 即可,并且 不能对蛋白进行加热变性. 而有些抗体只能识别蛋白的非还原状态如氧化状态,对此类标本,就 需要将缓冲液和凝胶中的还原剂 DTT 和 β-巯基乙醇去除. 先根据待测蛋白状态确定电泳条件:
待测蛋白状态 Reduced Denatured Reduced - Native Oxidized Denatured Oxidized - Native 不还原,不变性 还原,不变性 不还原,变性 凝胶条件 还原,变性 上样buffer 含β-巯基乙醇或 DTT,含SDS 含β-巯基乙醇或 DTT,不含SDS 不含β-巯基乙醇或 DTT,含SDS 不含β-巯基乙醇或 DTT,不含SDS
备注:除非说明书有特殊说明,一般 WB 均为变性和还原电泳条件.
电泳buffer 含SDS 不含SDS 含SDS 不含SDS
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WB 第 2 步:PAGE 电泳分离蛋白和转膜,封闭 一,电泳分离
制备凝胶 SDS-PAGE 凝胶可以购买商业化的也可以自行配制,不论选择哪种, 确定合适的凝胶浓度是十分关键的.凝胶的浓度取决于目的蛋白的分子量 大小,目的蛋白分子量越大,则凝胶浓度越低.参阅下表
根据待测蛋白分子量大小确定分离胶的浓度 蛋白分子量(kDa) 4-40 12-45 10-70 15-100 25-200 凝胶(分离胶)浓度(%) 20 15 12.5 10 8
选择合适的阳性对照: 阳性对照为已经明确表达目的蛋白的细胞或组织提取物,同时电泳, 杂交,以确定检测结果的准确性以及判定抗体的有效性.Abcam 抗体说明 书中一般有推荐的阳性对照类型, 同时 Abcam 还提供大量的细胞和组织裂 解物,可用作 WB 的阳性对照. 蛋白质分子量 Marker 蛋白质分子量 Marker 的使用, 是检测电泳效果和确定待测靶蛋白分子 量大小和正确与否的保证!预染 Marker 更方便直接观察电泳和转膜效果.
相关产品信息
目录号 ab41746 ab48854 产品描述 protein Molecular Weight Marker protein Molecular Weight Marker 规格 500ul 500ul 价格 1860 1860 分子量范围 14.6-112kDa 8.5-70kDa
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上样与电泳 将处理后的标本直接上样到 SDS-PAGE 胶加样孔内即可.为了便于观 察电泳效果和转膜效果,以及判断蛋白分子量大小,通常选择蛋白质分子 量 Marker(市售有不同大小的预染和非预染蛋白 Marker) . 电泳时间: 通常电泳时溴酚蓝到达胶的底端处附近即可停止电泳,或 者可以根据预染蛋白质分子量标准的电泳情况,预计目的蛋白已经被适当 分离后即可停止电泳.
二,转膜
杂交膜是 WB 进行的介质,选择合适的,高质量的杂交膜对整个 WB 的实验是非常重要和关键的.可以根据不同的检测目的和待测蛋白的特性, 选择合适的膜类型. 常用的转移膜类型有:PVDF 膜,硝酸纤维素膜(NC 膜)和尼龙膜, 其中 PVDF 和 NC 膜的使用频率最高.各种膜的技术参数及比较如下:
PVDF 膜 灵敏度和分辨率 背景 蛋白结合能力 高 低 100-200ug/cm (适用 于 SDS 存在时与蛋白结合) 机械强度 溶剂抗性 使用前是否需要浸 润 适用染色方法 胶体金,丽春红,酰胺黑,印度 墨汁,考马斯亮兰 适用检测方法 显色法,化学发光,荧光,放射 性,化学荧光,快速免疫检测 适用范围 普通蛋白 WB,糖蛋白检测,蛋 胶体金,丽春红, 酰胺黑, 印度墨汁 显色法,化学发 光,荧光,放射性 普通蛋白 WB,氨 不能用阴离子 染料 显色,化学发 光,放射性 低浓度小分子 强 强 100%甲醛润湿 干的膜易脆 差 缓冲液润湿 软而结实 差 缓冲液润湿
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NC 膜 高 低 80-100ug/cm
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尼龙膜 高 较高 >400ug/cm2
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我要抗体 51AB PVDF 膜
51AB 无忧抗体 NC 膜 基酸分析, 重复检 测. 0.1um 膜适用 于 7kDa 以下蛋白 尼龙膜 蛋白,酸性蛋 白,糖蛋白,蛋 白多糖, 核酸检 测常用
白质测序,氨基酸分析,重复检 测
价格
高
较低
低
备注:PVDF膜需要小心预处理:将膜剪成合适的大小,在甲醇中浸润1-2分钟 后,在预冷的转膜buffer中孵育5分钟,凝胶也需要在预冷的转膜buffer中平衡3 -5分钟.否则在转膜过程中会出现皱缩,导致出现转移的条带变形
转膜时间一般为 30-60 分钟.也可以在 15-20mA 转膜过夜.具体的转 膜时间要根据目的蛋白的大小而定,目的蛋白的分子量越大,需要的转膜 时间越长,目的蛋白的分子量越小,需要的转膜时间越短. 在转膜过程中,特别是高电流快速转膜时,通常会有非常严重的发热 现象,最好把转膜槽放置在冰浴中进行转膜. 转膜后,确定转膜效率至为重要,可通过以下方法检测: 1, 在转膜后使用丽春红(可逆染色)对杂交膜染色,同时使用考马斯亮蓝 对转膜后的凝胶进行染色, 检测凝胶上的蛋白是否已经完全充分的转移 到杂交膜上. (膜有很清晰的蛋白条带,而凝胶上无蛋白存在) . 2, 使用预染蛋白 Marker,检测 Marker 的转移情况,当和目的蛋白大小相 当的 Marker 完全转移后即可停止,但是有时需要相对延长一些时间, 因为 Marker 相对目的蛋白会比较容易转移. 对于大分子量或者小分子量蛋白的转膜注意事项: 转膜缓冲液中SDS和甲醇的比例,蛋白分子量大小和凝胶的浓度都能 影响到转膜的效率.对于一些大分子量或者小分子量的蛋白,可通过以下 方法来增加转膜效率. 对于大分子量蛋白(>100 kD)
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大分子量蛋白转移很慢,就像他们在凝胶中分离的比较慢一样. 确保大分子量蛋白的凝胶浓度低于8%. 大分子量蛋白容易沉淀在凝胶中,难于转移,可在转膜缓冲液中 加入0.1%的SDS来缓解该现象.另外甲醇可能会将SDS从蛋白中 去除,所以将转膜缓冲液中的甲醇浓度降到10%或以下,可以使 转膜更加容易进行. 只有在使用硝酸纤维素膜(NC膜)时,甲醇才是必须的.如果使 用PVDF膜,可将甲醇从转膜缓冲液中去除(只在前期膜处理的时 候使用甲醇). 选择在4℃转膜过夜,来替代常规的半干转膜. 对于小分子量蛋白(<100 kD) SDS不利于蛋白质和膜的结合,小分子量蛋白尤其明显.如果目 的蛋白很小的话,可将SDS从转膜缓冲液中去除. 保持甲醇的浓度在20%. 另外,如果你的目的蛋白大于500kDa,请参考以下文献来确定有效 的转膜: Bolt and Mahoney, High-efficiency blotting of proteins of diverse sizes following sodium dodecyl sulfate–polyacrylamide, gel electrophoresis. Analytical Biochemistry 247, 185–192 (1997).
关于转膜的注意事项:
避免直接使用手碰杂交膜,使用镊子.因为手上的蛋白和油脂会影响转膜 效率并会使膜脏掉. 夹好膜和凝胶后,确定在凝胶/膜和滤纸之间没有气泡存在,否则会导致转 膜不完全.
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保证膜和滤纸的大小和凝胶完全一样,过大或过小都会影响转膜效率 鸡来源的抗体与 PVDF 和尼龙膜有较强的结合能力, 从而产生较高的背景, 故如果选择鸡来源的抗体最好使用硝酸纤维素膜.
三,封闭
杂交膜上有很多非特异性的蛋白质结合位点,为防止这些位点与抗体 结合引起非特异的染色和背景,一般用惰性蛋白质或非离子去污剂封闭膜 上的未结合位点来降低抗体的非特异性结合.封闭剂应该封闭所有未结合 位点而不替换膜上的靶蛋白,不结合靶蛋白的表位,也不与抗体或检测试 剂有交叉反应.常用的封闭试剂有 1-3%的 BSA 或者 5%的脱脂奶粉,缓冲 液一般选择 PBST 或者 TBST. 一般封闭条件为:室温或者 37℃ 1-2hr,特殊情况也可 4℃过夜.根 据结果情况调整封闭试剂的浓度和类型.比如有时 BSA 比脱脂奶粉更有利 于降低非特异性背景,而有些抗体则在脱脂奶粉封闭的情况下才能得到清 晰的背景. 封闭完成后要进行洗膜,以去除膜上未结合的封闭试剂.洗涤液使用 TBST 或者 PBST,其中的 Tween 有助于去除非特异性的结合,减少背景. 同时短时间多次的洗膜(如 5-6 次,每次 3 分钟)比长时间少次数的洗膜 更有效. Protein Block: 专门设计的即用型封闭试剂, 适用于 IHC, WB, ELISA. 组份:BSA, Casein, PBS, Sodium Azide, pH 7.4 WB 用法:室温孵育 1hr 或者 4 过夜
目录号 产品说明 规格 目录价格
ab64226
Protein Block
125ml
1308
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在选择封闭剂时,要注意一些特殊情况.例如:
1) 2) 3)
脱脂奶粉不能与生物素化或伴刀豆蛋白标记的抗体一起使用,因为脱 脂奶粉含有糖蛋白和生物素. 如果封闭剂中含磷酸酶,用磷酸化特异性抗体分析磷酸化蛋白会受到 影响,因为磷酸酶与印迹膜上的磷酸化蛋白接触可使之去磷酸化. 检测磷酸化抗体时,不能使用酪蛋白/脱脂奶粉作为封闭试剂
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WB 第 3 步:抗体孵育和检测
一,一抗孵育
一抗的选择成功与否,是整个 WB 实验成功的关键:选择一抗有以下几个 注意点: 1, 选择适合检测标本种属的一抗(说明书有验证) 2, 选择适用于 WB 实验方法的一抗(说明书有验证) 3, 选择单克隆抗体或者经过亲和纯化的多克隆抗体 一抗的保存和使用: 1) 根据说明书的要求条件进行抗体的保存;一般需要将抗体分装后放入 -20℃保存,绝对避免反复冻融. 2) 抗体的工作液最好现配现用,在 4℃保存最好不要超过 2 周 3) 由于实验室条件和检测方法等的差异,说明书推荐的稀释比例只作参 考,需要在说明书推荐的浓度周边进行多个浓度梯度的实验检测,然后 选择信噪比最好的抗体浓度进行实验. 4) 根据说明书推荐浓度使用 TBST 稀释一抗.如果说明书没有推荐浓度, 可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度(1:100-1:3000) . ,根据抗体亲和 5) 孵育条件:推荐 4°C 孵育过夜(一般大于 18 个小时) 力不同孵育时间有所区别.也可以室温 1-2hr. 6) 抗体稀释液:有些实验室惯于使用含有封闭试剂(BSA 或者脱脂奶粉) 的 TBST/PBST 来作为抗体稀释液,而有些实验室则惯于直接使用 TBST/PBST 作为抗体稀释液.具体需要根据实验结果来做出适当的调 整. 7) 洗涤液使用 TBST 或者 PBST,其中的 Tween 有助于去除非特异性的 结合,减少背景.同时短时间多次的洗膜(如 5-6 次,每次 3 分钟)比 长时间少次数的洗膜更有效.
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注意:如果背景不是很高,很多抗体在含有低浓度 BSA 或脱 脂奶粉(0.25-0.5%)的稀释液中会有很好的信号.
Abcam 作为全球前 5 位的抗体供应商, 提供超过 4 万种高质量的抗体, 其中大部分抗体是适用于 WB 检测的.Abcam 最具优势的产品包括以下: 神经生物学(Neuroscience) :超过 14300 种产品 干细胞(Stem Cell) 超过 11000 种产品 : 染色质(Chromatin) :超过 6000 种产品 肿瘤生物学(Cancer) :超过 12300 种产品 核信号通路(Nuclear Signaling) :超过 13500 种产品 信号转导(Signal Transduction) :超过 25600 种产品 细胞生物学(Cell Biology) 超过 11000 种产品 : 免疫学(Immunology) :超过 12700 种产品 心血管研究(Cardiovascular) :超过 9600 种产品 发育生物学(Developmental Biology) :超过 2100 种产品 微生物学(Microbiology) :超过 3300 种产品 内参的使用――WB 过程监测以及目的蛋白定量的标准! 在 WB 试验中,最重要和最不可或缺的对照就是内参照(Loading Control, Internal Control).内参照的使用有两个方面的作用: 1. 是检测整个 WB 实验过程及体系是否正常工作,如果一个实验连内 参照都出不了阳性结果的话(在内参抗体有效的情况下),那么这 个体系就是存在问题的了 2. 半定量的标准:内参一般选择管家基因编码表达的蛋白,在很多组 织和细胞中都是稳定表达的,因此可以作为检测靶蛋白表达量的标 准. 021-61130227/8/9
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WB 常用内参及其技术参数
内参名称 beta-actin GAPDH Tubulin VCDA1/Porin COXIV TBP 分子量大小 43kDa 30-40kDa 55kDa 31kDa 16kDa 38kDa 适用范围 胞浆和全细胞 胞浆和全细胞 胞浆和全细胞 线粒体 线粒体 细胞核
Don't be a cowboy, use a Loading Control!
Beta-Actin antibody [AC-15] (ab6276) at 1/5000 dilution, Lysates/proteins at 20 g per lane Lane 1 : HeLa nuclear Lane 2 : HeLa whole cell lysate Lane 3 : A431 cell lysate Lane 4 : Jurkat cell lysate Lane 5 : HEK293 cell lysate. www.51antibody.com
beta Actin antibody [mAbcam 8224] - Loading Control (ab8224) Lane 1 : Drosophila lysate at 20 g Lane 2 : S. pombe lysate Lane 3 : S. cerevisiae lysate
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我要抗体 51AB 目录号 ab4074 ab7291 ab6160 ab21057 ab21058 ab6046 ab7287 ab13822 产品说明
51AB 无忧抗体 反应种属 Hu,Ms,Rt,Ch,Co,C HO Pi,Hu,Ms,Rt,Xe,Co, Ch,Do, Gp Ms,Mamm,Dm,Sc, S pom Hu Hu,Ms Hu,Ms,Rat,Chk,Ch Hm Ch,Co, Gp,Hu,Ms,Pi,Rt,Xe Hu,Ms,Rt,Rb,Xe,Co , Do,F,Cho Hu,Ms,Rb,Rt,Ch,C hHt,Co,Do,Fruit fly),Pi,AGMk,Sc Hu,Ms,Rt,Carp,Ca, Ch,Co,Do,Dm,Gp, Ht,Mk,Pi,Rb,Sh Hu,Ms,Rb,Rt,Xe,Ca ,Ch,ChHt,Co,Do,Fr uit fly,Pi,Sc,S pom Ms,Rt,Rb,Ch,Co,D o,Hu,Pi,Cho Hu,Ms,Rb,Xe,Co,C 16
Abcam 提供种类齐全的内参抗体,完全满足您的所需!
Rabbit polyclonal to alpha Tubulin-Loading Control Mouse monoclonal [DM1A] to alpha Tubulin-Loading Control Rat monoclonal [YL1/2] to Tubulin-Loading Control Goat polyclonal to beta Tubulin-Loading Control Rabbit polyclonal to beta Tubulin-Loading Control (HRP) Rabbit polyclonal to beta Tubulin-Loading Control Mouse monoclonal [DM1B] to beta Tubulin-Loading Control Chicken polyclonal to beta Actin-Loading Control Mouse monoclonal [mAbcam 8226] to beta Actin-Loading Control (HRP) Mouse monoclonal [AC-15] to beta Actin (HRP) Mouse monoclonal [AC-15] to beta Actin Mouse monoclonal [mAbcam 8224] to beta
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Actin-Xenopus,Drosophila and Yeast Loading Control Mouse monoclonal [mAbcam 8226] to beta Actin-Loading Control Rabbit polyclonal to beta Actin-Loading Control
ab8226 ab8227
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51AB 无忧抗体 反应种属 h,Do,F,Cho,Sh
ab14744 ab16056 ab33985 ab59414 ab59423 ab59426 ab14734 ab15895 ab9385 ab9482 ab9484 ab9485 ab62125 ab62126
Mouse monoclonal [20E8] to COX IV-Mitochondrial Loading Control Rabbit polyclonal to COX IV-Mitochondrial Loading Control Mouse monoclonal [mAbcam33985] to COX IV-Mito Loading Control Mouse monoclonal [mAbcam59414] to COX IV-Mito Loading Control Mouse monoclonal [mAbcam59423] to COX IV-Mito Loading Control Mouse monoclonal [mAbcam59426] to COX IV-Mito Loading Control Mouse monoclonal [20B12] to VDAC1 / Porin-Mito Loading Control Rabbit polyclonal to VDAC1 / Porin-Mitochondrial Loading Control Rabbit polyclonal to GAPDH-Loading Control (HRP) Mouse monoclonal [mAbcam 9484] to GAPDH-Loading Control (HRP) Mouse monoclonal [mAbcam 9484] to GAPDH-Loading Control Rabbit polyclonal to GAPDH Mouse monoclonal [mAbcam 62125] to TBP-Nuclear Loading Control Mouse monoclonal [mAbcam 62126] to TBP-Nuclear Loading Control and ChIP Grade www.51antibody.com
Hu,Ms,Rt,Co,Ht Hu,Ms,AGMk,Ptto, Xl Hu,Ms,AGMk,Co,M k,Xl Hu,Ms,Co Hu Hu,Ms,Co Hu Ch,Hu,Do,ChHt Hu,Ms,Rt,Xe,Sc
Hu,Ms,Rt,Rb,Xe,Co ,Ch,Do,Pi,ChHt Hu,Ms, Rt, Xe Hu Hu
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51AB 无忧抗体 反应种属 Hu,Ms,Rt Hu,Ms,Rt
Mouse monoclonal [1TBP18] to TBP-Nuclear Loading Control and ChIP Grade Mouse monoclonal [mAbcam 51841] to TBP Nuclear Loading Control and ChIP Grade
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二,二抗孵育
二抗选择: 根据一抗来源种属以及抗体 Ig 亚型选择合适的二抗. 比如, 如果一抗是小鼠 IgG 来源的抗体,二抗需选择抗小鼠 IgG 的;如果一抗是 小鼠 IgM 来源的抗体,则二抗要选择抗小鼠 IgM 的. 根据说明书推荐浓度使用 TBST 稀释二抗.如果说明书没有推荐浓度, 可进行多个稀释比例进行摸索最佳稀释度(1:1000-1:20000) .孵育条件一 般为室温 1-2 小时. 抗体稀释液:有些实验室惯于使用含有封闭试剂(BSA 或者脱脂奶粉) 的 TBST/PBST 来 作 为 抗 体 稀 释 液 , 而 有 些 实 验 室 则 惯 于 直 接 使 用 TBST/PBST 作为抗体稀释液.具体需要根据实验结果来做出适当的调整. 洗涤液使用 TBST 或者 PBST,其中的 Tween 有助于去除非特异性的 结合,减少背景.同时短时间多次的洗膜(如 5-6 次,每次 3 分钟)较长 时间少次数的洗膜更有效. Abcam 提供针对多个种属,多种亚型,多种标记的二抗,配套 Abcam 的一抗使用,是非常理想的搭配!
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目录号 ab6876 ab6877 ab6740 ab6741 产品说明 Goat polyclonal to Chicken IgY H&L (biotin) Goat polyclonal to Chicken IgY H&L (HRP) Rabbit polyclonal to Goat IgG H&L (biotin) Rabbit polyclonal to Goat IgG H&L (HRP) 规格 1mg 1mg 1mg 1mg 价格 1800 1860 1860 1860 18
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我要抗体 51AB 目录号 ab6742 ab6884 ab6885 ab6886 ab6908 ab6909 ab5745 ab5746 ab6783 ab6892 ab6727 ab6728 ab6729 ab6788 ab6789 ab6790 ab6720 ab6721 ab6722 ab6801 ab6802 ab6803 ab6734 ab6844 ab6845 ab6846 ab6746 (HRP) 产品说明
51AB 无忧抗体 规格 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 500ug 500ug 1.5mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 1mg 价格 1860 1860 1860 1860 1860 1860 1860 1860 1860 1860 1860 1860 1860 1860 1860 1860 1860 1860 1860 1860 1860 1860 1860 1860 1860 1860 1860 19
Rabbit polyclonal to Goat IgG H&L (AP) Donkey polyclonal to Goat IgG H&L (biotin) Donkey polyclonal to Goat IgG H&L (HRP) Donkey polyclonal to Goat IgG H&L (AP) Goat polyclonal to Guinea Pig IgG H&L (HRP) Goat polyclonal to Guinea Pig IgG (AP) Rabbit polyclonal to Hamster (Armenian) IgG H&L Goat polyclonal to Hamster (Armenian) IgG H&L (AP) Rabbit polyclonal to Hamster IgG H&L (HRP) Goat polyclonal to Hamster IgG H&L (HRP) Rabbit polyclonal to Mouse IgG H&L (biotin) Rabbit polyclonal to Mouse IgG H&L (HRP) Rabbit polyclonal to Mouse IgG H&L (AP) Goat polyclonal to Mouse IgG H&L (biotin) Goat polyclonal to Mouse IgG H&L (HRP) Goat polyclonal to Mouse IgG H&L (AP) Goat polyclonal to Rabbit IgG H&L (biotin) Goat polyclonal to Rabbit IgG H&L (HRP) Goat polyclonal to Rabbit IgG (AP) Donkey polyclonal to Rabbit IgG H&L (biotin) Donkey polyclonal to Rabbit IgG H&L (HRP) Donkey polyclonal to Rabbit IgG (AP) Rabbit polyclonal to Rat IgG H&L (HRP) Goat polyclonal to Rat IgG H&L (biotin) Goat polyclonal to Rat IgG H&L (HRP) Goat polyclonal to Rat IgG H&L (AP) Rabbit polyclonal to Sheep IgG H&L (biotin) www.51antibody.com
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我要抗体 51AB 目录号 ab6747 产品说明
51AB 无忧抗体 规格 1mg 价格 1860
Rabbit polyclonal to Sheep IgG H&L (HRP)
Abcam提供更多种类和标记的二抗,请登录www.abcam.com或者致电艾碧康查询!
三,底物孵育和检测
化学发光法(ECL) :灵敏度高,已经成为一种使用趋势,推荐使用.需要 暗室或者检测仪器.更推荐使用灵敏度更高的 ECL+. 显色法:操作简单,无需暗示等曝光设备.
HSP 70 倍比稀释检测,一抗和二抗稀释比例均为 1:50000,使 用 Abcam HRP 发光底物孵育 5 分钟后曝光检测结果
相关产品信息
目录号 产品描述 规格 价格
ab5801 ab79907 ab7468 ab7413
Chemiluminescent HRP Substrate (membrane) Chemiluminescent Reagent Kit AP chromogen (BCIP/NBT) – R.T.U Alkaline Phosphatase chromogen (BCIP/TNBT)
1kit(60ml) 1kit 100ml 100ml
3696 3720 1860 1860
关于杂交膜的反复利用
很多实验室因为标本比较珍贵,或者为了节省膜的用量,惯于将杂交 膜反复利用,即检测一个蛋白后用洗脱液处理后再检测另一个目的蛋白. 请参照附录中的洗脱 buffer 配方!
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我要抗体 51AB
51AB 无忧抗体
WB 过程中常见的问题及可能原因分析
问题 可能原因 膜没有完全均匀湿透 靶蛋白分子量小于 10,000 靶蛋白等电点等于或接 近转移缓冲液 pH 值 转膜不充分 甲醇浓度过高 验证或解决办法 使用 100% methanol 浸透膜 选择小孔径的膜,缩短转移时间 可尝试使用其他缓冲液如 CAPS 缓冲液 (pH 10.5)或使用低 pH 值缓冲液如乙酸缓冲液 过高甲醇浓度会导致蛋白质与 SDS 分离, 从而沉淀在凝胶中,同时会使凝胶收缩或变 硬,从而抑制高分子量蛋白的转移.降低甲 醇浓度或者使用乙醇或异丙醇代替 转移时间不够 膜没有完全均匀湿透 洗膜不充分 对于厚的胶以及高分子量蛋白需要延长转 移时间 使用 100% methanol 浸透膜 增加洗液体积和洗涤次数 增加封闭液孵育时间,或者提高温度.选择 封闭不充分 合适的封闭试剂(脱脂奶粉,BSA,酪蛋白 等) 二抗浓度过高 背景高 检测过程中膜干燥 曝光过度 抗体与封闭蛋白有交叉 反应 降低二抗浓度 保证充分的反应液,避免出现干膜现象 缩短曝光时间 检测抗体与封闭蛋白的交叉反应性,选择无 交叉反应的封闭剂.洗涤液中加入 Tween-20 可减少交叉反应 增加一个二抗对照:不加一抗,其他操作过 二抗的非特异性背景 程不变,即可验证背景是否由二抗系统来 源.选择其他二抗(特异性更强的,只针对 www.51antibody.com 021-61130227/8/9
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我要抗体 51AB 问题 可能原因 重链的) 抗体染色不充分
51AB 无忧抗体 验证或解决办法
增加抗体浓度,延长孵育时间 直接将酶和底物进行混合,如果不显色则说
酶失活
明酶失活了.选择在有效期内,有活性的酶 联物 设置阳性对照,如果阳性对照有结果,但标
标本中不含靶蛋白或靶 没有阳性条带 蛋白含量太低
本没有则可能是标本中不含靶蛋白或靶蛋 白含量太低.可考虑增加标本上样量解决靶 蛋白含量低的原因. 一抗与组织种属, 一抗与二抗或/和底物与酶
试剂之间不匹配
系统之间不匹配.通过设置内参照可以验证 二级检测系统的有效性
一抗失效 HRP 抑制剂 抗体染色不充分
选择在有效期内抗体;并选择现配现用的工 作液 所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠 增加抗体浓度,延长孵育时间 直接将酶和底物进行混合,如果不显色则说
酶活性降低
明酶失活了.选择在有效期内,有活性的酶 联物
标本中靶蛋白含量太低 有阳性条带, 但条带比较弱 洗膜过度 抗体活性降低 蛋白转移不充分 封闭过度 曝光时间过短 HRP 抑制剂
增加标本上样量. 缩短洗涤时间 选择在有效期内的抗体,工作液现配现用, 避免长时间放置 见上述 减少封闭剂的量或缩短时间;换用不同封闭 剂类型 延长曝光时间 所用溶液和容器中避免含有叠氮化钠
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我要抗体 51AB 问题 可能原因
51AB 无忧抗体 验证或解决办法 增加一个二抗对照:不加一抗,其他操作过
二抗的非特异性结合
程不变,即可验证背景是否由二抗系统来 源.选择其他二抗(特异性更强的,只针对 重链的)
一抗的特异性不够 蛋白降解 抗体浓度过高
使用单克隆或者亲和纯化的抗体,保证抗体 的特异性 使用新鲜制备的标本,并使用蛋白酶抑制剂 降低抗体(一抗,二抗)浓度,可以减少非 特异性条带 有些来源于同一基因的蛋白有不同的剪切
非特异性条带 (多条带)
不同剪切体存在
方式,每个剪切方式得到的蛋白大小都是不 同的
细胞传代过多, 导致蛋白 变异 蛋白上样量过大 二聚体或多聚体存在
使用原代或传代少的细胞作对照 降低上样量 增加蛋白质变性过程及强度 比如很多蛋白是以前体蛋白的形式合成的,
翻译后剪切 条带位置(大 小)不对; 相对电荷(Relative charge) 蛋白修饰 封闭剂中有聚集体 背景有黑色斑 点 抗体与封闭试剂反应 HRP 耦联二抗中有聚集 体 背景有不均匀 转膜过程中有气泡存在 www.51antibody.com
在执行功能时需要进行剪切成活化的形式, 如 pro-caspases 氨基酸的组成(charged vs non-charged) 比如糖基化,磷酸化等修饰状态会导致蛋白 分子量增加 使用前过滤封闭试剂 使用前过滤封闭试剂 过滤二抗试剂,去除聚集体 仔细检测,避免存在气泡 021-61130227/8/9 23
我要抗体 51AB 问题 的白色斑点 膜上出现反像 (暗背景上白 色带) 电泳速度过快 微笑条带 电泳温度过高 抗体和 Marker 蛋白反应 HRP 含量过高 可能原因 抗体分布不均匀
51AB 无忧抗体 验证或解决办法
孵育抗体时使用摇床
降低酶联二抗的浓度
减少电压等减慢电泳速度 在冷室或者冰浴中进行电泳,改变电泳 pH 值 在 Marker 和 sample 之间空出一个孔不上样
Marker 变黑色
关于磷酸化蛋白检测的注意事项:
保持待测蛋白处于磷酸化状态!在标本提取液中加入足够的磷酸酶抑制 剂,并将标本时刻保持在冰浴中! 使用 5%的 BSA 作为封闭试剂!不能使用脱脂奶粉!(因为脱脂奶粉中含 有酪蛋白,会出现高背景) 请谨记蛋白的磷酸化是需要诱导的!当信号低或者无信号时有可能是磷酸 化诱导不充分!确保使用阳性对照!
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我要抗体 51AB
51AB 无忧抗体
附录:
WB常用缓冲液配方
蛋白提取相关buffer: Buffer名称 细胞骨架蛋白提取 buffer 10 mM Tris, pH 7.4; 1 mM EDTA; 1 mM NaF; 2 mM Na3VO4 ; 10% glycerol; 可溶性蛋白提取 buffer: RIPA 裂解液 (RadioImmuno Precipitation Assay buffer) Nonidet-P40 (NP-40) 裂解液 核蛋白提取相关试 剂: 20 mM Tris HCl pH 8 137 mM NaCl 10% glycerol 1% nonidet P-40 2 mM EDTA Buffer A – 10 mM HEPES, 1.5 mM MgCl2, 10 mM KCl, 0.5 mM DTT, 0.05% NP40 (或0.05% Igepal 或 Tergitol) pH 7.9 按如下方法准备250 ml储存液buffer A: HEPES: 1M = 238.3 g/L, 则10 mM = 0.59 g/250 ml MgCl2: 1M = 203.3 g/L, 则1.5 mM = 0.076 g/250 ml KCl: 1M = 74.5 g/L, 则10 mM = 0.187 g/250 ml DTT: 1M = 154.2 g/L, 则0.5 mM = 0.019 g/250 ml NP40 = 0.05% Buffer B – 5 mM HEPES, 1.5 mM MgCl2, 0.2 mM
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配方 100 mM NaCl; 1 mM EGTA; 20 mM Na4P2O7; 1% Triton X-100; 0.1% SDS; 0.5% deoxycholate
20 mM Tris-HCl, pH 7.5; 1 mM EGTA (Ca2+ chelator) 50mM Tris HCl pH 8 150 mM NaCl 1% NP-40 0.5% sodium Deoxycholate 0.1% SDS
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我要抗体 51AB
51AB 无忧抗体
EDTA, 0.5 mM DTT, 26% glycerol (v/v), pH 7.9 按如下方法准备250 ml储存液buffer B: HEPES: 1M = 238.3 g/L, 则5 mM = 0.295 g/250 ml MgCl2: 1M = 203.3 g/L, 则1.5 mM = 0.076 g/250 ml EDTA: 1M = 372.2 g/L, 则0.2 mM = 0.0186 g/250 ml DTT: 1M = 154.2 g/L, 则0.5 mM = 0.019 g/250 ml 26% Glycerol (v/v) = 65 ml 4.6 M NaCl - 87.66 g/326 ml 10% sodium deoxycholate 储存液(5g加入50 ml水) 必须避光保存. 100 mM EDTA储存液:1.86 g加入40 ml H2O,然后加入NaOH调整pH到7.4. 调整总体积到50ml.4°C保存. 其他常用buffer Buffer名称 TBS 10x 储存液: 配方 24.23 g Trizma HCl 80.06 g NaCl 加入800ml超纯水混匀,用纯HCl调整pH到 7.6,加水到1L. TBST TBS (Tris Buffered Saline) pH 7.6-7.8 TBS 0.025% Triton X-100: PBS: 1%BSA TBS buffer 1L溶液: 100 ml 10xTBS + 900 ml 超纯水+ 1ml Tween20 10L: 60.6 g TRIS HCl; 13.9 g TRIS base 87.66 g NaCl 10 litres 超纯水 (H2O) 1L: 250 μl Triton X-100; 999.75 ml TBS pH 7.6-7.8 1.16g Na2HPO4, 0.1g KCl, 0.1g K3PO4, 4g NaCl (500 ml双蒸水) pH 7.4 10 mg BSA; 1ml TBS pH 7.6-7.8
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我要抗体 51AB
51AB 无忧抗体
反复利用杂交膜,洗脱buffer: Buffer名称 Medium stripping buffer: 加超纯水至总体积1 L 洗脱步骤: 1. 加入可覆盖膜的洗脱液,室温孵育5-10分钟,弃液体 2. 再用新鲜的洗脱液孵育5-10分钟,弃液体 3. PBS洗膜2次,每次10m分钟 4. TBST洗膜2次,每次5 分钟 膜处理完毕可重新开始封闭等下一个抗体检测 Harsh stripping buffer 100 ml:20 ml 10%SDS,12.5 ml 0.5M Tris-HCl pH 6.8 , 67.5 ml 超纯水, 在通风橱中加0.8ml -mercaptoethanol 洗脱步骤: 1. 将洗脱液预热到 50°C. 2. 将洗脱液放到有紧紧盖子的小塑料盒中,量以能覆盖 膜为宜 3. 加入膜,在 50°C 孵育 45 分钟,间断摇动 4. 加入 -mercaptoethanol based buffers. 5. 用流水冲洗膜 1-2 小时 6. 用 TBST 洗膜 5 分钟去除多余的 -mercaptoethanol 膜处理完毕可重新开始封闭等下一个抗体检测 配方 15g glycine, 1g SDS ,10 ml Tween20,调节pH值到2.2,
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