第二章 核酸的分离纯化 Chapter 2 Extraction & Purification of Nucleic Acid
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第一节 核酸的分离纯化
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一,核酸分离,纯化原则
I. 保持核酸分子一级结构的完整性 II. 防止核酸的生物降解
二,分离提取核酸的主要步骤
I. 细胞的破碎 II. 核蛋白的解聚,变性蛋白的去除 III. 核酸的沉淀 IV. 核酸的浓度测定 V.
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核酸的保存
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前 言
核酸(nucleic acid)是遗传信息的携带者, 是基因表达的物质基础. 无论是进行核酸结构还是功能研究,首 先需要对核酸进行分离和纯化. 核酸样品质量将直接关系到实验的成败.
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一,核酸分离,纯化原则
(一) 保持核酸分子一级结构的完整性 1 意义
遗传信息全部储存在一级结构之中,核酸 的—级结构还决定其高级结构的形式以及和其他 生物大分子结合的方式.
2 分离核酸原则:
①温度不要过高; ②控制一定的pH值范围(pH值5-9); ③保持一定的离子强度; ④减少物理因素对核酸降解的机械剪切力.
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(二) 防止核酸的生物降解
细胞内或外来的各种核酸酶能消化核 酸链中的磷酸二酯键,破坏核酸一级结构. 所用器械和一些试剂需高温灭菌,提 取缓冲液中需加核酸酶抑制剂.
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1 DNA酶抑制剂
1) 金属离子螯合剂: DNA酶需要金属二价离子Mg2+,Ca2+的激 活,因此使用金属二价离子螯合剂,可抑制 DNA酶活性.如EDTA-Na2等. 2) 阴离于型表面活性剂: 如SDS,该试剂除对核酸酶有抑制作用外,还 能使蛋白质变性,并与变性蛋白结合成带负 电荷的复合物,该复合物在高盐溶液中沉淀.
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2 RNA酶(RNase)抑制剂
RNAase分布广泛,极易污染样品, 而且耐高温,耐酸,耐碱,不宜失活. 常用的RNase抑制剂有: (1) 皂土(bentonite) 作用机制:皂土带负电荷,能吸附 RNase,使其失活.
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(2) DEPC(二乙基焦碳酸盐) (C2H5OCOOCOOC2H5)
粘性液体,很强的核酸酶抑制剂.
作用机制:与蛋白质中His结合使蛋白变性. 使用注意:
①DEPC也能破坏单链核酸中大部分腺嘌呤环.但浓度
比使蛋白质变性的浓度大100～1000倍. ②容易降解,保存在4 ℃或液氮中; ③提RNA时,0.1% DEPC浸泡器皿37℃ 2 h. ④剧毒.
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其它RNA酶抑制剂
(3) 肝素 (4)复合硅酸盐(Macaloid) (5) RNase阻抑蛋白(RNasin) (6) 氧钒核糖核苷复合物 (VanadylRibonucleoside Complex, VRC)

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