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3944 ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R V—= ae$ /
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李冬斌, 等. 短发夹RNA对胰腺癌细胞PANC-1突变型K-ras基因表达的影响 3945
和Fleming et al[12]也用RNAi技术特异地抑制了
K-ras基因的表达.
多数学者认为, 抑制细胞生长的机制是诱导
细胞凋亡或阻滞细胞周期. 但也有少数结果显
示单纯阻断突变型K-ras基因的表达并不能有效
诱导细胞凋亡, 因此, RNAi作用于胰腺癌K-ras
基因的确切的机制尚需进一步研究. 另外我们
目前对基因功能复杂性的认识仍然不够, 尤其
对外源基因表达的时空性的控制很难准确操纵,
当一些蛋白的表达受抑制时, 为维持正常代谢
功能, 其他相关补偿途径可能被激活. RNAi效应
分子对基因的抑制率一般也很难达到100%. 因
此RNAi虽然具有特异性好, 效率高等优点, 但在
临床应用中仍然具有一定的风险, 尚需进一步
继续研究.
本研究利用RNAi技术, 采用pGensil-1质粒
构建重组质粒载体, 并成功转导入人胰腺癌细
胞株PANC-1, 通过RT-PCR,Western blot方法
验证了含shRNA的重组质粒载体可有效抑制人
胰腺癌细胞中突变型K-ras基因的表达, CCK-8
法示可明显抑制细胞的增殖, 而且将重组的
pGensil-1-P1质粒注射到荷瘤裸鼠的瘤体内后可
以减缓瘤体增长速度, 呈现明显的抑瘤效应. 因
此我们可以认为以突变型K-ras基因为靶点, 利
用RNAi技术治疗肿瘤可望成为一种有效的基因
治疗方法.
4 参考文献
1 Howe JR, Conlon KC. The molecular genetics of
pancreatic cancer. Surg Oncol 1997; 6: 1-18
2 Brummelkamp TR, Bernards R, Agami R. Stable
suppression of tumorigenicity by virus-mediated
RNA interference. Cancer Cell 2002; 2: 243-247
3 Shen YM, Yang XC, Yang C, Shen JK. Enhanced
therapeutic effects for human pancreatic cancer
by application K-ras and IGF-IR antisense
oligodeoxynucleotides. World J Gastroenterol 2008;
14: 5176-5185
4 Downward J. RNA interference. BMJ 2004; 328:
1245-1248
5 Aoki Y, Cioca DP, Oidaira H, Kamiya J, Kiyosawa
K. RNA interference may be more potent than
antisense RNA in human cancer cell lines. Clin Exp
Pharmacol Physiol 2003; 30: 96-102
6 Wang S, Chai YB, Liu F, Zhang XY, Jia W, Xie X, Yu
WQ, Shang ZC, Jin BQ, Sun BZ. [Effect of specifc
siRNA targeting against bcr-abl chimeric gene on
chronic myelogenous leukemia cells] Zhonghua
Yixue Zazhi 2005; 85: 198-202
7 Wilda M, Fuchs U, W ssmann W, Borkhardt A.
Killing of leukemic cells with a BCR/ABL fusion
gene by RNA interference (RNAi). Oncogene 2002;
21: 5716-5724
8 Wang YH, Liu S, Zhang G, Zhou CQ, Zhu HX,
Zhou XB, Quan LP, Bai JF, Xu NZ. Knockdown of
c-Myc expression by RNAi inhibits MCF-7 breast
tumor cells growth in vitro and in vivo. Breast
Cancer Res 2005; 7: R220-R228
9 Zhao H, Ardelt B, Ardelt W, Shogen K,
Darzynkiewicz Z. The cytotoxic ribonuclease
onconase targets RNA interference (siRNA). Cell
Cycle 2008; 7: 3258-3261
10 Cerny WL, Mangold KA, Scarpelli DG. K-ras
mutation is an early event in pancreatic duct
carcinogenesis in the Syrian golden hamster. Cancer
Res 1992; 52: 4507-4513
11 Chen LM, Le HY, Qin RY, Kumar M, Du ZY, Xia
RJ, Deng J. Reversal of the phenotype by K-rasval12
silencing mediated by adenovirus-delivered siRNA
in human pancreatic cancer cell line Panc-1. World J
Gastroenterol 2005; 11: 831-838
12 Fleming JB, Shen GL, Holloway SE, Davis M, Brekken
RA. Molecular consequences of silencing mutant
K-ras in pancreatic cancer cells: justifcation for K-ras-
directed therapy. Mol Cancer Res 2005; 3: 413-423
编辑 史景红 电编 何基才
ISSN 1009-3079 CN 14-1260/R 2008年版权归世界华人消化杂志
消息
中国科技期刊引证报告(核心版)发布WJG
2007年影响因子0.745
本刊讯 2007年World Journal of Gastroenterology(WJG)的总被引频次为4431, 位居全部1723种中国科技论
文统计源期刊的第14位, 内科医学类28中期刊的第1位. 2007年WJG的影响因子为0.745, 内科医学类28种期
刊的第10位. 即年指标0.163, 他引率0.85, 引用刊数482种, 扩散因子10.88, 学科影响指标0.73. (编辑: 程剑侠
2008-12-18)
■同行评价
本文选题是医学
目前仍难以攻克
的恶性肿瘤治疗
的基础研究, RNA
干扰技术也是近
年来研究的热点.
虽内容上创新性
稍嫌不足, 参考文
献较旧, 但实验方
法,结果和统计
分析过程均较为
严谨, 可重复性较
高, 因此结论可
靠.