中国农业科学 2006,39(11):2384-2389 Scientia Agricultura Sinica
苦马豆素-BSA 免疫山羊的血清相关酶评价
童德文,董 强,赵宝玉,刘文明,李 立,赵 俊
(西北农林科技大学动物科技学院,杨凌 712100)
摘要: 【目的】通过评价 SW-BSA 免疫山羊的血清相关酶,探索 SW-BSA 免疫接种后对动物机体组织器官的保 护作用. 【方法】将 24 只山羊随机分为免疫对照组,免疫攻毒组和攻毒组,其中免疫对照组和免疫攻毒组接种 SW-BSA,免疫攻毒组和攻毒组拌料饲喂 10 g/kg BW/d 甘肃棘豆草粉攻毒. 【结果】血清 GOT,GPT,LDH,AKP,BUN, AMA 和抗体效价的检测结果表明,免疫攻毒组山羊较攻毒组山羊 LDH 活性升高延缓 28 d,AKP 活性升高延缓 14 d, AMA 活性降低延缓 21 d,BUN 活性升高延缓 14 d,GOT 活性升高延缓 28 d.攻毒后免疫攻毒组山羊抗 SW 抗体水平 降低,但在攻毒的第 21 天有一反弹,之后逐渐下降. 【结论】这些酶活性延缓变化和抗体水平变化,说明在甘肃 棘豆攻毒的前 30 d 内,SW-BSA 能够有效地延缓 SW 对山羊肝脏,心脏和肾脏等组织器官的损伤. 关键词:SW-BSA;血清酶;甘肃棘豆;山羊
Evaluation on Related Serum Enzyme of SW-BSA Immune Goats
TONG De-wen, DONG Qiang, ZHAO Bao-yu, LIU Wen-ming, LI Li, ZHAO Jun
(College of Animal Science and Technology, Northwest Sci-Tech & University of Agriculture and Forestry, Yangling 712100)
Abstract: 【Objective】The study evaluated serum enzyme of SW-BSA immune goats to probe the protection of the animal's tissue and organ protection after vaccinating with SW-BSA. 【Method】 24 goats were randomly separated into 4 groups. Goats were placed in an immune control, and goats placed in the immune poisoning groups were vaccinated with SW-BSA. Goats in immune poisoning and poisoning groups were fed 10 g/kg BW/d power of O. kansuensis Bunge. 【Result】 The changes of serum GOT, GPT, LDH, AKP, BUN, AMA and antibody against SW showed that the increasing level of LDH and GOT had been delayed 28 days. The increasing level of AKP and BUN had been delayed 14 days, the decreasing level of AMA had been delayed 21 days. This was in immune poisoning goats, as compared to the poisoning goats. The antibody level against SW decreased. However, there was a rebound at day 21, and then it decreased gradually. 【Conclusion】These results indicated that in 30 days, SW-BSA had effectively prevented goat liver, kidney, and heart from being injured by SW. Key words:SW-BSA; Serum enzyme; O. kansuensis Bunge; Goat
0
引言
【本研究的重要意义】疯草(Locoweed)是豆科
疯草蔓延还可促使草场退化,降低草场利用率,给草 【前人研究进展】 原畜牧业造成巨大的经济损失[3, 4]. 国内外学者自 1873 年至今对动物疯草中毒做了大量 研究.由于动物灰苦马豆(Swainsonia canescens)中 毒的临床症状,病理变化和临床生化指标的变化与人 类和动物的遗传性溶酶体贮积病-甘露糖过多症 (mannosidosis) 极为相似, 而甘露糖过多症是由于缺 乏 α-甘露糖甙酶(α-mannosidase)引起的.故澳大利 亚学者 Colegate 等[5]于 1979 年利用 α-甘露糖甙酶为
黄芪属(Astragalus)和棘豆属(Oxytropis)有毒植物 的总称,也是世界范围内危害草原畜牧业生产最为严 重一类毒草,在中国主要分布于西部广大草原,危害 并且日趋蔓延 面积达 1 100 万 ha ,
2 [1,2]
. 采食疯草后的
动物不仅会中毒死亡,而且会导致母畜流产,不孕, 造成胎儿畸形和公畜不育, 影响动物繁殖和畜种改良.
收稿日期:2006-01-07;接受日期:2006-05-16 基金项目:国家自然科学基金(30371067)和霍英东教育基金(91033)资助项目 作者简介:童德文 (1967-) 男, , 安徽太湖人, 副教授, 博士, 研究方向为动物病理学和毒理学. 029-87091192; Fax:029-87092164; E-mail:tdw8888@ Tel: sina.com
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童德文等:苦马豆素-BSA 免疫山羊的血清相关酶评价
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检测工具,首次从灰苦马豆中分离出一种纯毒素,并 鉴定其结构为苦马豆素(swainsonine,SW) .Huxtable 等[6]1982 年将灰苦马豆与斑夹黄芪(A. lentiginosus) 和绢毛棘豆(O. sericea)毒性进行了的比较,结果发 现,试验动物中毒后不仅临床症状一致,而且病理组 织学变化也没有差异,都表现神经细胞和部分内脏细 胞空泡化.鉴于这一发现,美国学者 Molyneux 等
[7]
1.2 试验方法 1.2.1 SW-BSA 抗原液的制备 准确称取 SW-BSA 溶 于注射用生理盐水后,加入等体积完全福氏佐剂,注 射器对抽至完全乳化,SW-BSA 抗原液的终浓度取决 于 SW-BSA 的质量和乳化液的体积. 1.2.2 SW-BSA 免疫山羊试验 将 24 只山羊随机分 为免疫对照组 8 只, 免疫攻毒组 12 只 (其中免疫攻毒 A 组 6 只,免疫攻毒 B 组 6 只) ,攻毒组 4 只.饲养 对免疫对照组和免疫攻毒组进行基础免 观察 10 d 后, 疫, 在每只羊腹股沟分 4 点皮下注射 5 ml 完全福氏佐 剂(以下各次免疫途径相同,抗原液体积均为 5 ml) . 免疫对照组的免疫时间和抗原液终浓度与免疫攻毒 A 免疫攻毒 A 组和 B 组的免疫时间和抗原液终 组相同, 浓度见下表. 1.2.3 甘肃棘豆草粉攻毒试验 第 2 次加强免疫 60 d 后,每日清晨,对攻毒组和免疫攻毒组每只羊以 10 g/kgBW/d 准确称量并拌料饲喂甘肃棘豆草粉进行攻 毒.开始攻毒前对所有试验山羊第 1 次空腹采血,以 后每隔 7 d 采血 1 次,直到免疫攻毒组山羊出现典型 疯草中毒症状,共计采血 10 次. 1.2.4 血清生化指标的测定 检测血清谷草转氨酶 (GOT)和谷丙转氨酶(GPT) ,采用赖氏法;血清乳 酸脱氢酶(LDH) ,采用顺向反应比色法;血清碱性 磷酸酶(AKP) ,采用磷酸苯二钠法;血清尿素氮 (BUN) ,采用二乙酰一肟法;血清–α–甘露糖苷酶 (α–Manase) ,采用比色测定法[12,13]. 1.2.5 间接 ELISA 试验 参考文献[14]间接 ELISA 法测定血清抗 SW 抗体效价 (n) 用 0.1%鞣酸 37℃ 1 , h 鞣化酶标板,3 μgml-1 的 SW 包被,酶标 2 抗为兔 抗羊 IgG-HRP.血清作连续 2 倍稀释, 以 490 nm 时 P/N>2.1 为有阳性反应,n 为有阳性反应的血清稀释 倍数的对数值,表示效价(log2) . 1.2.6 统计方法 应用 SPSS 12.0 软件, 采用 One-Way ANOVA(单因子方差分析)并结合 Duncan 和 LSD (least significant difference)法.
以 Colegate 分离得到的 SW 为标准品从斑夹黄芪和绢 毛棘豆中分离到 SW,并认为 SW 是疯草的主要有毒 成分. 【本研究的切入点】疯草除含有毒素外,其粗蛋 白含量高达 11%～12%,有作为优良饲草的潜力 . 在防治疯草方面,国内外研究者多从灭除毒草的角度 出发,但这些方法大多易破坏草场植被,而且经济成 本高
[9,10] [8]
. 【拟解决的关键问题】本研究以 SW 与大分
子载体蛋白 BSA 的化学合成产物 SW-BSA 为免疫原 接种动物,甘肃棘豆草粉攻毒,通过评价血清学指标 的变化和抗体水平变化,验证动物获得了免疫力并在 采食疯草时得到保护.
1
材料与方法
1.1 试验材料 1.1.1 试验动物 24 只健康莎能青年奶山羊,16 周 龄,体重(25.33±4.72)kg,购于陕西省周至县,免 疫前观察 10 d. 1.1.2 甘肃棘豆草 2004 年 8 月采集于青海省湟中 县,干燥粉碎,阴凉处保存备用. 1.1.3 1.1.4 SW-BSA 由西北农林科技大学生物毒素与
[11]
分子毒理学研究实验室合成 试验试剂
.
对 硝 基 苯 -α-D- 甘 露 糖 ( 4-
Nitrophenyl-α-D-mannopyranoside),购于 SIGMA 公 司,其余化学试剂均为国产分析纯. 1.1.5 试验仪器 Techcomp UV1102 型分光光度计 (Beckman Coulter 公司生产) ,其它常规仪器由西北 农林科技大学生物毒素与分子毒理学研究实验室提 供.
表 免疫攻毒 A 组和 B 组的免疫时间和抗原液终浓度
Table
The immune time and the final concentration of antigens in immune poisoning A and B
首免 The first immunization A B 1.5 1 10 第 1 次加强免疫 The first booster immunization A 2 25 B 3 第 2 次加强免疫 The second booster immunization A 12 40 B 18
抗原液与免疫时间 Antigens and immune time 抗原液终浓度 The final concentration of antigens(mgml-1) 基础免疫后时间 The day after basic immunization(d)
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结果与分析
LDH 活性测定结果见图 1-A.从第 7 天,攻毒组
2.4 BUN 活性测定结果与分析 BUN 活性测定结果图 1-D.从第 21 天起,攻毒 组 BUN 活性持续升高,第 56 天达到最高水平;免疫 攻毒 A 组和 B 组 BUN 活性分别从第 35,21 天起开 始持续升高,在第 63 天到达最高水平,即免疫攻毒 组 BUN 活性较攻毒组延缓 14 天升高.从第 21～35
2.1 LDH 活性测定结果与分析 LDH 活性持续升高,第 42 天升高到较高水平;从第 35 天,免疫攻毒 A 组和 B 组 LDH 活性均开始升高, 第 63 天升高到最高水平, 与攻毒组相比, 免疫攻毒组 LDH 活性开始升高延缓 28 d,其较高水平延缓 21 d 到达.从第 7～35 天,攻毒组的 LDH 活性显著高于 免疫攻毒 A 组, 组和免疫对照组 B (P<0.05) 第 42～ . 63 天,攻毒组,免疫攻毒 A 组和 B 组的 LDH 活性均 显著高于免疫对照组(P<0.05) . 2.2 AKP 活性测定结果与分析 AKP 活性测定结果见图 1-B. 攻毒组 AKP 活性从 第 7 天起持续升高, 28 天升高到最高水平; 第 免疫攻 毒组从第 21 天起 AKP 活性持续升高, 42 天达到最 第 高水平,即免疫攻毒组 AKP 活性较攻毒组延缓 14 天 升高.第 7 天,攻毒组 AKP 活性显著高于免疫攻毒 B 组(P<0.05) ;第 14 天,攻毒组 AKP 活性显著高于 免疫攻毒 A 和 B 组及免疫对照组(P<0.05) ;第 21 天, 攻毒组 AKP 活性显著高于免疫对照组 (P<0.05) ; 第 28 天和第 35 天,攻毒组,免疫攻毒 A 组和 B 组的 AKP 活性均显著高于免疫对照组(P<0.05) ;第 42 天,免疫攻毒 B 组显著高于免疫对照组(P<0.05) ; 第 49～63 天,攻毒组,免疫攻毒 A 组和 B 组的 AKP 活性均显著高于免疫对照组(P0.05) . 2.3 AMA 活性测定结果与分析 AMA 活性测定结果见图 1-C.从第 7 天,攻毒组 AMA 活性持续降低,第 28 天降低到最低水平;从第 35 d,免疫攻毒 A 组和 B 组 AMA 活性均开始降低, 在第 49 d 降低到最低水平,即免疫攻毒组 AMA 活性 较攻毒组延缓 21 天降低到最低水平.第 7～28 天, 攻毒组的 AMA 活性比免疫攻毒 A 组,B 组和免疫对 照组的 AMA 活性显著降低(P<0.05) .第 35 天,攻 毒组 AMA 活性比免疫攻毒 B 组和免疫对照组的 AMA 活性显著降低(P<0.05) ,但攻毒组 AMA 活性和免 疫攻毒 A 组无显著性差异, 说明此时免疫攻毒 B 组受 到抗体的保护要强于 A 组.第 42～63 天,攻毒组, 免疫攻毒 A 组和 B 组的 AMA 活性与免疫对照组间无 显著差异,而三者与 AMA 活性均存在显著差异(P <0.05) .
天,攻毒组的 BUN 活性与免疫攻毒 A 组,B 组和免 疫对照组相比显著性升高(P<0.05) .第 42 天,免疫 攻毒 A 组和 B 组 BUN 较免疫对照组活性显著性升高 (P0.05), 但 3 组与免疫对照组相比, BUN 活性均显著性升高 (P <0.05) . 2.5 GOT 活性测定结果与分析 GOT 活性测定结果见图 1-E.第 7～63 天,攻毒 组,免疫攻毒 A 组,免疫攻毒 B 组和免疫对照组 4 组 试验羊的 GOT 活性之间差异极显著(P<0.01) .从第 7 天起,攻毒组 GOT 活性持续升高,第 14 天攻毒组 GOT 活性升高到最高水平;从第 35 天起,免疫攻毒 A 组和 B 组 GOT 活性均开始升高,在第 49 天升高到 最高水平,即免疫攻毒组 GOT 活性较攻毒组延缓 28 天升高.第 7～28 天,攻毒组的 GOT 活性较免疫攻 毒 A 组,B 组和免疫对照组显著性升高(P<0.05) . 第 35～63 天,攻毒组,免疫攻毒 A 组和 B 组的 GOT 活性都较免疫对照组显著性升高(P0.05) ,且 GPT 活性均在正常范围内. 2.7 攻毒后抗 SW 抗体的变化 攻毒后血清抗 SW 抗体的测定直至免疫攻毒组山 羊血清抗 SW 抗体明显下降而结束.抗 SW 抗体变化 见图 2,可见攻毒后抗 SW 抗体下降,但免疫攻毒 A 组和 B 组在攻毒后第 21 天时都有一反弹,之后又缓 缓下降,直到第 49 天效价极低.
3
讨论
据报道[15,16],甘肃棘豆的主要有毒成分为 SW,
动物采食甘肃棘豆后,毒素在 7 d 左右引起机体酶发 生改变,20 d 后出现典型的中毒症状和病理变化,本 研究攻毒组山羊血清酶测定的结果进一步证实这一结 果.
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(●) 攻毒组,(◆) 免疫攻毒 A 组,(▲) 免疫攻毒 B 组,(■) 免疫对照组 (●) Poisoning group, (◆) Immune poisoning group A, (▲) Immune poisoning group B, (■) Immune control group
图1
各组山羊血清 LDH(A) ,AKP(B) ,AMA(C) ,BUN(D) ,GOT(E)和 GPT(F)活性测定结果
Fig. 1 Temporal changes of LDH (A), AKP (B), AMA (C), BUN (D), GOT (E) and GPT (F) in the serum of experimental goats
63 天, SW 抗体水平不足以保护免疫攻毒组羊而使 抗 LDH 活性升高.AKP 是血清中最早被检测并有一定 诊断意义的一种酶,主要分布于肝脏,肾脏和骨组织 中,当动物患肝胆病变时,活性升高[12].攻毒组 AKP 活性的测定结果与前人报道的动物疯草中毒的结果相 一致[15].免疫攻毒组 AKP 活性较攻毒组升高延缓 14 天,也说明在攻毒初期,SW-BSA 有效地防止了 SW 对山羊肝脏的侵害作用. 35 天起, 第 免疫攻毒组和攻 毒组的 AKP 活性差异不显著, 表明机体肝脏和肾脏开
(◆) 免疫攻毒 A 组,(▲) 免疫攻毒 B 组,(■) 免疫对照组 (◆) Immune poisoning group A, (▲) Immune poisoning group B, (■) Immune control group
始受到侵害.动物疯草中毒时,SW 可以抑制 α-甘露 糖苷酶活性,对 α-甘露糖苷酶有抑制作用[7,16].本研 究免疫攻毒组 AMA 活性较攻毒组延缓 21 d 降低.第 35 天,免疫攻毒 B 组对 AMA 活性的保护效果好于 A 组,说明较大免疫剂量保护效果较强.肾脏受损,可 引起血清尿素氮含量升高[12],免疫攻毒组 BUN 活性 较攻毒组延缓 14 d 升高,说明在攻毒初期,SW-BSA 有效地防止了 SW 对山羊肾脏的侵害作用. GOT 在体 内分布广泛,但主要以肝脏,心肌,肾脏等细胞内活 性最强[12],免疫攻毒组 GOT 活性较攻毒组延缓 28 d 升高,可说明肝,肾,心等器官的损伤相应延迟.攻 毒组,免疫攻毒 A 组,B 组和免疫对照组 4 组试验羊
图2
抗 SW 抗体变化
Fig. 2 Temporal change of antibody against SW
.
LDH 位于肝脏,肾脏,心肌等部位,其活性升高 示征这些组织器官受到侵害,王凯等
[14]
通过绵羊甘肃
棘豆中毒病理组织学检查观察到肝脏,肾脏,心肌有 病理损伤,这与本研究 LDH 活性上升有一致性.另 外,免疫攻毒组 LDH 活性较攻毒组延缓 28 d 升高, 说明在攻毒初期 SW-BSA 对山羊有保护作用. 42～ 第
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的 GPT 活性之间差异不显著,且均在正常范围内.说 明 SW 和 SW-BSA 都对 GPT 活性无影响. 对免疫山羊血清中抗 SW 抗体测定结果表明,免 , 疫山羊在第 2 加强免疫后第 60 d 达到最高水平(2 ) 并维持在较高水平的时间为 30 d.此时期有毒素进入 体内可以达到最佳保护效果,血清酶测定的结果也进 一步验证了这一结果.攻毒后抗 SW 抗体在下降,这 与机体中形成 SW-抗 SW 抗体复合体有关.但也注意 到免疫攻毒 A 组和 B 组在攻毒后第 21 天时都有一反 弹,个体最高水平可达到 2 ,这可能是机体蓄积的毒 素刺激机体免疫系统,又产生出抗 SW 抗体的缘故. 之后随着 SW-抗 SW 抗体复合体的形成,抗 SW 抗体 效价进一步下降.进一步研究重点为延长 SW-BSA 对 动物的保护时间,提高抗体效价以加强对动物疯草中 毒保护力.
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4
结论
本研究免疫攻毒山羊较攻毒山羊 LDH 活性升高
延缓 28 d,AKP 活性升高延缓 14 d,AMA 活性降低 延缓 21 d,BUN 活性升高延缓 14 d, GOT 活性升高 延缓 28 d.攻毒后抗 SW 抗体下降,但免疫攻毒 A 组 和 B 组在攻毒后第 21 天时都有一反弹,之后又缓慢 下降,直到第 49 天效价极低.这些酶活性延缓变化, 说明 SW-BSA 免疫动物后, 机体已产生 SW-BSA 诱导 的高水平抗 SW 抗体,并与进入体内的 SW 形成抗体 毒素复合体,在攻毒的前 30 d 内,能够有效地延缓 SW 对山羊肝脏,心脏和肾脏等组织器官的损伤.各 组织器官的损伤程度,不同攻毒剂量,病理性损伤与 抗体水平之间的关系等,将在随后的研究中报道.
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(责任编辑 白春霞)
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