(1): 23-30, 2010 台湾兽医志 Taiwan Vet J 36评估染剂转换对於一市售鸡只微阵列核酸晶片之效能影响
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评估染剂转换对於一市售鸡只微阵列核酸晶片之效能影响
1
王嘉兰
1, 2
蔡向荣
3
邱智贤
*1, 2 周崇熙
国立台湾大学兽医专业学院 2 国立台湾大学人畜共通传染病研究中心 3 国立台湾大学动物科学技术学系
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(收稿日期:98 年 7 月 30 日.接受日期:98 年 9 月 18 日)
摘要
核酸微阵列晶片分析技术能够同时检测大量基因的表现量差异,甚至能观察到未知的调控路径,是一种在探
讨基因变化相当实用的研究工具.然而此技术会因染剂与不同基因亲和性或是染剂自身稳定度等因素,而影响晶片结 果分析上的特异性及敏感度.随著鸡只的全基因序列被全部解析,目前虽已有商品化的鸡只基因微阵列晶片,仍需要 审慎评估其效能及使用上所必须注意的筛选标准.本实验利用染剂转换的试验设计,评估一市售鸡只微阵列晶片其可 能存在之染剂偏差效应及筛选标准的关系.结果发现的确存在染剂偏差的效应,因此该晶片数据需经适当的筛选进行 进一步分析,当差异倍数判断值设定在 1.5 倍时,染剂的偏差效应尚不足以影响基因改变量差异的判读结果,因此建 议后续研究者可使用此倍率做为判断值;同时若未经过讯号强度 (raw 值) 筛选的数据,即使将判断标准提升至差异 2 倍的较高标准,也发现其回归线 R2 值降低且整齐度不佳,结果可信赖度不佳,说明了以讯号强度做为筛选条件之一 的重要性.本评估结果可供其他研究者日后进行本型晶片研究分析时的参考指标.[王嘉兰,蔡向荣,邱智贤,* 周崇 熙.评估染剂转换对於一市售鸡只微阵列核酸晶片之效能影响.台湾兽医志 36 (1):23-30,2010.* 通讯作者 TEL: 886-2-3366-9735,FAX:886-2-2364-9154,E-mail:cchou@ntu.edu.tw ]
绪
言
一般探讨基因表现量的研究,需要对每个标的 基因设计具专一性的引子,经过即时反转录聚合 链 式 (Real-time reverse transcription PCR; RRTPCR) 反应,藉由增幅产物的浓度了解该基因表现 量的改变.然而,若欲了解整个基因调控路径 (pathway) 或路径网络,则必须耗费大量的人力与时 间,将所有可能相关的基因逐个检验后再加以整 合.而利用核酸微阵列晶片 (nucleotide microarray) 技术,能够同时检测数千至数万个大量的基因,使 得研究的时程相对地精简,甚至对於过去未曾探究 的基因或调控路径也有意外的收获.经过微阵列晶 片技术及软体分析,即能够对於基因群或调控路径
表现有全盘性地了解,因此微阵列晶片渐次成为重 要且实用的研究基因变化的工具之一.目前核酸微 阵列晶片主要可分为互补核酸阵列 (cDNA microarray) 及寡核酸阵列 (oligonucleotide microarray) 两 型.互补核酸阵列型晶片,先合成 300-800 个核 酸长度的 DNA,再将整段的 DNA 点铸在晶片上, 此型晶片制作难度不高,许多实验室皆有能力完 成,并且能够根据实验需求设计所需要的 DNA 序 列,因此对标的基因的特异性与敏感度较高,制作 成本亦较为经济且弹性.但是每个实验室制作技术 可能有所差异,因此於不同实验室甚至不同片的晶 片之间一致性表现较差,同时晶片上所能点铸的基 因数目较少,加上该段 DNA 为事先合成且片段较 长,因此可能会形成二级以上的结构,影响与标的
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王嘉兰 等
基因结合的亲和度.寡核酸阵列型晶片於晶片原位 分段点铸核酸至合成 18-70 个核酸长度,每个 晶片上所点铸提供检测的基因数目较多,市售化的 商品甚至可多达上万个基因,目前此型晶片大都已 商业化统一制作并经过品质管制,因此检测结果有 较高的一致性及重复性,但是价格则较为昂贵 [6, 8]. 微阵列晶片操作原理是将样本的 mRNA 反转 录成 cDNA,并且以萤光物质标示,再将标示过的 cDNA 与晶片上的核酸片段杂交.目前分为单色染 色系统与双色染色系统,单色系统是将不同处理的 样本 (例如来自於控制组与实验组的两套样材),分 别标识上一种同色的萤光染色物质后,各自於两片 晶片上进行杂交,侦测并比较萤光的亮度比值,以 换算成标的 mRNA 的表现量;双色系统则是将两 种不同颜色的萤光物质标示不同组别的 cDNA,通 常是控制组用 Cy3 (红色染色剂 ),实验组用 Cy5 ( 绿色染色剂 ) [6],再将染色的 cDNA 於同一片晶 片上进行杂交,因此双色系统使用上较单色系统经 济.单色系统较适用於多种处理组的比较,但若只 需比较两组间之差异,由於双色系统作用於同一片 晶片,更能减少不同晶片之间於制作过程所造成的 误差,根据 Patterson 等 [7] 的研究报告,单色与双 色系统微阵列晶片检测若经评估后效果接近,可根 据试验设计或个人使用习惯选用之.但是其他研究 则发现在双色系统中可能因为 Cy3 及 Cy5 两种染 料之间的对於标的基因的亲和性不同 [5],染料之 间的亲和性 [2],以及染料裂解 (quench) 的情况不 同 [2]等原因,将造成侦测基因表现讯号时的误 差.此外在互补核酸阵列晶片中,点铸的基因密度 越高时,受到染剂误差 (dye bias) 的影响会越大 [2].因此使用双色系统之前宜进行特殊的试验设 计如染剂转换 (dye swap) 的方式评估双色染剂对於 该晶片及实验的适用性.染剂转换的实验设计由同 一来源 RNA 样本分为两群,一群的染色剂使用方 式为「控制组-Cy3,实验组-Cy5」,另一群则将 染色剂对换,即「控制组-Cy5,实验组-Cy3」, 然后将两群样本分别在两片微阵列晶片上进行杂 交.藉由比对两次晶片的结果,了解该微阵列晶片 受到染剂误差的影响程度,透过数学计算,筛选条 件或是进阶试验设计排除可能之误差,以适用於进 一步的实验 [3].综观过去的研究评估结果,认为 需将基因表现量差距判断值设定在 2 倍以上,较不 受到染剂误差的影响,所得出的判定结果可信度较 高 [5].但若经评估后确认染剂误差的影响程度轻 微,表示染剂裂解速率稳定或是染剂对於标的基因

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