有机2无机杂化材料膜制备生物传感器
用于在线生化需氧量的测定
刘长宇 屈建莹 郏建波 齐 力 董绍俊3
(中国科学院长春应用化学研究所电分析化学国家重点实验室,长春130022)
摘 要 用溶胶2凝胶与接枝共聚物组成的有机2无机杂化材料固定皮状丝孢酵母制备BOD生物传感器,在
研制的在线BOD监测仪上考察其性能.结果表明,该传感器线性高达85.0mg/LBOD,稳定性良好,使用寿
命长,可连续使用90d以上,保存14个月后仍可保持70%以上的活性.本方法用于实际样品分析,得到了与
传统的5d法较一致的结果,可用于污水的在线监测.
关键词 溶胶2凝胶,生物传感器,生化需氧量,在线生化需氧量监测仪
2004206217收稿;2004212208接受
本文系国家科技部"十五"国家科技攻关资助课题(No.2001BA210A04)
1 引 言
在生化需氧量(BOD)生物传感器的研制中,固定化材料及固定化方法的选择对BOD微生物传感器
的稳定性和重现性有很大影响.近年发展起来的溶胶2凝胶衍生的玻璃材料已发展成适合于固定生物
分子的一类新型材料[1,2],这类无机材料具有物理刚性,化学惰性,较高的光,热稳定性及可忽略的溶胀
性而特别适合于构建生物传感器;此外,接枝共聚物所含有的大量羟基有助于为固定化的生物分子提供
生物相容性的微环境,故以接枝共聚物为基础的生物传感器有高的灵敏度和很好的生物相容性[3].将
两种材料的特性结合起来而制备新型有机2无机杂化材料固定化膜,生物相容性好,能防止溶胶2凝胶成
膜时的开裂和接枝共聚物的溶胀性[4].该杂化材料在固定酶或蛋白质以制备生物传感器方面已显示
出广阔的应用前景[5～7].在已被广泛研究的微生物中,皮状丝孢酵母因被证明具有较广泛的有机物降
解范围,良好的稳定性而被日本工业标准协会选定用做生产BOD生物传感器的标准[8].
本研究采用溶胶2凝胶与接枝共聚物组成的有机2无机杂化材料固定皮状丝孢酵母制备的BOD生
物传感器.考察了在研制的XSF21型在线BOD监测仪上的本传感器性能.实验显示了良好的稳定性
和重现性,样品测试结果与BOD5值具有较好的相关性,预计在环境监测领域中将有广阔的应用前景.
2 实验部分
2.1 试剂与仪器
正硅酸乙酯(天津化工厂);聚乙烯醇接枝42乙烯基吡啶(PVA2g2PVP)据文献[9]合成;三甲基氯硅
烷(德国Sigma公司);皮状丝孢酵母(T.cutaneum,2.570)(中国科学院微生物研究所);葡萄糖(北京
化工厂);L2谷氨酸(上海政翔化学试剂研究室);牛肉膏,蛋白胨,酵母提取物(上海化学试剂公司);
BOD标准样品(SRMBOD5l)(北京国家环保总局标准样品研究所).其它试剂均为分析纯.根据
GB7488287BOD测量标准,GGA标准溶液由谷氨酸(C5H9NO4)和无水葡萄糖(C6H12O6)配制而成.将
谷氨酸和葡萄糖置于103℃烘箱中干燥1h,准确称取以上两种物质各150.0mg,蒸馏水溶解并定容至
100mL.PBS缓冲体系:0.02mol/LKH2PO420.04mol/LNa2HPO4,pH7.0.XSF21型在线BOD监测仪
为中国科学院长春应用化学研究所与江苏江分电分析仪器厂联合研制,具有自动稀释,自动进样,自动
标定功能,可实现样品的在线分析.BOD探头采用传统的三电极体系,镀金属纳米粒子的金电极
(<1.0mm)为工作电极,Ag/AgCl(0.1mol/LKCl)电极为参比电极,铂丝为对电极,工作电压为-700
mV,并配备优质的透氧膜.
第33卷
2005年5月
分析化学(FENXIHUAXUE) 研究报告
ChineseJournalofAnalyticalChemistry

第5期
609～613
2.2 微生物的培养
皮状丝孢酵母所用培养基为:2%蛋白胨,1%酵母提取物,2%葡萄糖.取一定量配制好的培养基分装
图1 微生物膜的安装示意图
Fig.1 Fixingsketchofthemicroorganismmembrane
至250mL锥形瓶中,灭菌,接种,30℃摇床培养36h
后4000r/min离心10min,弃上清液,以PBS充分洗
涤3次,再稀释使其吸光度到0.8(λmax=540nm,以
PBS为参比),取一定量的该溶液离心分离,所得湿菌
体加入适量PBS混合均匀即可用于制备生物膜.
2.3 生物膜的制备及生物传感器的组装
PVA2g2PVP溶解得一定浓度的水溶液即为水凝
胶(hydrogel);溶胶2凝胶(sol2gel)是由正硅酸乙酯,
水,乙醇和盐酸按一定比例混合并超声而得.将Sol2gel,T.cutaneum,hydrogel按一定比例混合均匀后制备
生物膜于4℃保存.电极的组装如图1所示.首先将透氧膜装在电极套上,向电极套中加入适量的支持电
解质,再将活化好的微生物膜紧贴到透氧膜上,加上膜压圈,拧紧流通池.电极的结构如图2所示.
图2 BOD生物传感器结构图
Fig.2 Structureofbiochemicaloxygen
demand(BOD)biosensor
2.4 测量方法与原理
测量方式为流动式,测量温度通过恒温装置保持在30℃,
缓冲体系为pH7.0的PBS缓冲液,测量时间为10min,流速
为4.0mL/min.BOD生物传感器处于清洗状态时,PBS由蠕
动泵传送到生物传感器表面,此时由缓冲溶液经微生物膜,透
氧膜扩散至生物传感器的氧浓度达到一稳态,生物传感器输
出一稳定的电位值E0;当含有葡萄糖和谷氨酸的标准溶液流
经微生物膜时,与缓冲溶液处于相同状态的标准溶液中的溶
解氧和有机分子均向电极微生物层扩散,但因微生物对有机
物发生同化作用而消耗氧(微生物处于外源性呼吸状态),使
扩散至生物传感器的氧分子减少,10min内建立起新的平衡,输出电位降低至新的稳态值,根据前后电位
差ΔE与对应的标准溶液浓度间的关系绘制标准曲线.实际样品分析时,样品由自吸泵取至测量桶,根据
实际情况选择是否稀释及稀释倍数,在选定条件下测试样品ΔE值并根据标准曲线计算BOD含量.
3 结果与讨论
3.1 生物膜的活化周期
生物膜在使用之前需在30℃恒温条件下活化24～36h,继续在电极表面活化24h使E0达到稳定.
实验表明,新膜的活化周期短于久置生物膜的活化周期,若活化微生物膜的缓冲液含有一定浓度的有机
物有利于缩短活化周期.图3a和图3b分别为活化温度对新膜E0,ΔE的影响.由图可以看出,新膜经
过36h的恒温活化其E0及ΔE达到稳定时间要明显小于室温下活化的微生物膜.
3.2 生物膜保存及使用寿命
前期工作表明,在4℃下微生物膜保存3个月仍然保持80%活性[10].为验证生物膜结构的稳定性
及其低温下生物活性的维持,将4℃下保存14个月的生物膜浸泡于PBS中活化50d,所得标准曲线与
新膜比较,其响应信号值约为新膜的70%,但仍然具有较好的线性关系(r=99.69%).
采用此生物膜制备的传感器对长春市南湖游泳区水样进行测量,7次测量的平均值是3.04mg/L,
相对标准偏差为5.4%;BOD5的分析结果是2.98mg/L.
温度在一定范围内升高,微生物活性也将增加[10],但会导致生物膜的寿命缩短.实验在35℃下对
不同浓度的样品进行连续考察,微生物膜在连续使用60d天后仍然保持着初始大小的响应信号(如
图4).实验结果表明,微生物膜具有良好的储存稳定性和工作稳定性,这可能是因为硅溶胶2凝胶的孔
径效应将微生物牢固地固定在共聚物内,避免了微生物的泄漏,而PVA2g2PVP中的大量的羟基能提供
良好的生物相容性的微环境[10].
016 分析化学第33卷
图3 活化温度对新膜E0(a)和ΔE(b)的影响
Fig.3 InfluenceofactivationtemperatureonE0(a)andΔE(b)ofnewlypreparedbiomembrane
缓冲溶液(buffer):pH7.0;T:30℃;流速(flowrate):3.0mL/min;反应时间(reactiontime):10min;待测
溶液(sample):C5H9NO42C6H12O6mixture(GGA)standardsolution.1,2分别是新膜在30℃下和室温下
活化36h后E0随时间变化曲线(1,2representE02timecurveswiththenewbiomembraneactivatedfor36h
at30℃androomtemperature,respectively).3,4分别是新膜在30℃下和室温下活化36h后ΔE随时间
变化曲线(3,4representcurvesofΔE2timewithnewmembraneactivatedfor36hat30℃androomtempera2
ture,respectively);BOD:3.35.0mg/L;4.15.0mg/L.
图4 工作状态下稳定性考察
Fig.4 Stabilityofthebiosensorinwork2
ingcondition
BOD:1.4.5mg/L;2.30.0mg/L;3.15.0
mg/L;4.5.0mg/L.测量条件同图3(other
condiitonsasinFig.3).
3.3 测试条件的优化
3.3.1 提高流速对恢复时间的影响 为缩短仪器的实际测量周
期,考虑到提高流速来减少清洗恢复的时间.实验表明:提高流速
会使恢复曲线上升的斜率增加,在很短时间内便高出初始E0值,但
将流速调至4mL/min后会持续下降,35min后低于初始E0100
mV;而采用8～4mL/min逐渐降低的恢复方法,某种程度降低了上
述现象,但对软件有较高的要求.在实际应用中恢复时间的长短不
直接影响仪器性能,因此测量结束后均在4mL/min下恢复.
3.3.2 流通管路等因素对测量的影响 流动体系所使用的软管质
量严重影响测量结果.通过对比实验,观察到聚乙烯软管的使用效
果较好.传感器的线性相关系数保持在99.37%以上,线性高达
85.0mg/L,同时也使标准曲线的使用周期延长至一个月.长时间
使用的管路,膜表面以及流通池内会存留各种杂质,将会导致测量
结果的偏高(见表1).用使用15d和30d的膜进行测量,可以看
出,管路使用时间越长,测量结果就越高,而且不同浓度样品的测量值在清洗管路前后的差值大致相等.
其原因可能是所固定的微生物有一定的增殖[10],而空气饱和水的过程可能造成好氧微生物在流路系统的
增殖.为延长管路使用周期,预先将管路用100%三甲基氯硅烷作硅烷化处理,得到比较满意的结果.管
路使用一个月后的标准曲线与初始时比较未见增长,结果见图5.
表1 清洗管路对测量值的影响
Table1 Influenceofwashedpipe
15.0mg/L
15d
E0(mV)ΔE(mV)
30d
E0(mV)ΔE(mV)
25.0mg/L
15d
E0(mV)ΔE(mV)
30d
E0(mV)ΔE(mV)
清洗前Beforewashing1486350.01520907144151415801198
清洗后Afterwashing1615264172235316383971791642
对比ContrastΔE0129Δ(ΔE)86ΔE0202Δ(ΔE)554ΔE0197Δ(ΔE)117ΔE0211Δ(ΔE)555
测量条件同图3(determinationconditionsasinFig.3)
3.3.3 流速及缓冲液浓度的选择 前期实验流速采用4mL/min,仪器24h开机,因此缓冲液消耗过
大.考虑到节省资源,更适合于在线仪器的监测,降低流速到2.5mL/min对仪器性能进行了考察,结果
116第5期刘长宇等:有机2无机杂化材料膜制备生物传感器用于在线生化需氧量的测定
见表2.由表2中数据可知:流速的改变不影响E0,ΔE的变化,降低流速使测量样品到达流通池的时间
增加,测量结束后的恢复时间也有一定增加,但可以通过简化管路来补偿,并且不影响仪器的使用性能.
图5 硅烷化处理管路对测量值的影响
Fig.5 Influenceonmeasurementby
tubingpretreatmentofsilanization
1.1d(r=99.62%);2.30d(r=99.93%);
测量条件同图3(determinationconditionsasin
Fig.3).
同时磷酸盐浓度降低至0.005mol/L考察一个月,实验结果未见
任何异常.
表2 降低流速对E0及ΔE的影响
Table2 InfluencetoE0andΔEofreducedflowrate
含量
Content
(mg/L)
流速
Flowrate
(mL/min)
E0
(mV)
ΔE
(mV)
测量值
Found
(mg.L)
恢复时间
Recovertime
(min)
25.0
4.0
2.5
1621.0
1558.5
1554.0
525.4
507.3
506.7
25.6
24.4
24.3
40
45
40
其他测量条件同图3(otherconditionsasinFig.3)
3.4 标准加入法在检测实际废水中的应用
本实验采用标准加入法对长春市南湖游泳区水样进行测量,
结果列在表3中.标准加入结果与传统的BOD5方法结果符合,
说明仪器采用标准加入方法同样可以得到满意结果.对于成分
复杂的样品可考虑使用标准加入法.
表3 标准加入法测量某湖水样
Table3 MeasurementoflakewaterusingSRMBOD5lasstandardadditionsolutions
标准加入浓度
AddedSRMBOD5l
(mg/L)
ΔE(mV)SBOD
(mg/L)
BOD5
(mg/L)
标准加入浓度
AddedSRMBOD5l
(mg/L)
ΔE(mV)SBOD
(mg/L)
BOD5
(mg/L)
10311.615447.14.634.37
20530.5
其他测量条件同图3(otherconditionsasinFig.3).
References
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忠).ChinaPatent(中国专利).CN96123528.4,1996
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OnlineMeasurementofBiochemicalOxygenDemandUsingaMicrobial
SensorBasedonOrganic2InorganicHybridMaterial
LiuChangyu,QuJianying,JiaJianbo,QiLi,DongShaojun3
(StateKeyLaboratoryofElectroanalyticalChemistry,ChangchunInstituteofAppliedChemistry,
ChineseAcademyofSciences,Changchun130022)
Abstract Arapidandstablebiochemicaloxygendemand(BOD)biosensorusingtheorganic2inorganic
216 分析化学第33卷
hybridmaterialforimmobilizationofTrichosporoncutaneumwasfabricated,andappliedforon2lineanalysis.
Thebiosensorresponsetothesampleexhibitedgoodreproducibilityandlong2termstability.Itonlytakes
10minforeachmeasurement.GoodagreementwasobtainedbetweentheresultsfromthesensorBOD
measurementandtheconventionalBOD5methodforwatersamples.Thelinearrasponseofthesensorisupto
acorrespondingBODvalueof85.0mg/L.Thebio2filmhadhighactivityeventhestoragetimeislongerthan
14months.Also,theinstrumentcanbeusedtoon2linemonitorthewastewater.
Keywords Sol2gel,biosensor,biochemicaloxygendemand,onlinebiochemicaloxygendemandanalyzer
(Received17June2004;accepted8December2004)
中国蛋白质组学第三届学术大会
(第二轮通知)
为了促进我国蛋白质组学的研究与发展,由中国生物化学与分子生物学会蛋白质组学专业委员会(筹)和中国人类
蛋白质组组织(CNHUPO)(筹)主办,中国科学院长春应用化学研究所承办,中国蛋白质组学第三届学术大会定于2005
年7月25-27日在长春市召开.
一,会议安排:
本届学术会议设有大会报告,分会(专题)报告和墙报三种形式.大会将邀请国内外著名专家,院士和教授作蛋白
质组学及相关领域的热点和难点问题的综述和专题报告.
会议同时举办与生物化学,分子生物学,蛋白质组学等研究领域相关的仪器,设备,试剂和新技术的展览,展示会
(安排公司,厂商等workshop).
欢迎国内外学者和公司,厂商等参加会议并在论文摘要集中发布广告.
二,会议议题:
会议主要讨论蛋白质组学研究的现状及其进展,内容包括:功能蛋白质组学,药物蛋白质组学,疾病蛋白质组学,结
构蛋白质组学,动物,植物,微生物蛋白质组学,蛋白质化学,蛋白质生物信息学,蛋白质相互作用,蛋白质组及相关技术,
蛋白质组微分析与蛋白质芯片,抗体制备等.
三,联系方式:
长春市人民大街5625号 中国科学院长春应用化学研究所李壮邮政编码:130022;电话:(0431)5262057;
5262421;13166872879;传真:(0431)5262057;E2mail:zli@ciac.jl.cnzlimeeting@yahoo.com.cn;
会议网址:http://www.skleac.org
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316第5期刘长宇等:有机2无机杂化材料膜制备生物传感器用于在线生化需氧量的测定