人细胞纤维连接蛋白(cFn)酶联免疫分析试剂盒使用说明书 本试剂盒仅供研究使用 特异性:本试剂盒可同时检测天然或重组的人 cFn,且与其他相关蛋白无交叉反应. 有效期:6 个月 预期应用:ELISA 法定量测定人血清,血浆,细胞培养上清或其它相关生物液体中 cFn 含量. 说明 1.试剂盒保存:-20℃(较长时间不用时);2-8℃(频繁使用时). 2.浓洗涤液低温保存会有盐析出,稀释时可在水浴中加温助溶. 3.中,英文说明书可能会有不一致之处,请以英文说明书为准. 4.刚开启的酶联板孔中可能会含有少许水样物质,此为正常现象,不会对实验结果造成任何影响. 实验原理 用纯化的抗体包被微孔板,制成固相载体,往包被抗 cFn 抗体的微孔中依次加入标本或标准品,生物素化 的抗 cFn 抗体,HRP 标记的亲和素,经过彻底洗涤后用底物 TMB 显色.TMB 在过氧化物酶的催化下转化成蓝 色,并在酸的作用下转化成最终的黄色.颜色的深浅和样品中的 cFn 呈正相关.用酶标仪在 450nm 波长下 测定吸光度(OD 值),计算样品浓度. 试剂盒组成及试剂配制 1. 酶联板(Assay plate ):一块(96 孔). 2. 标准品(Standard):2 瓶(冻干品). 3. 样品稀释液(Sample Diluent):1×20ml/瓶. 4. 生物素标记抗体稀释液(Biotin-antibody Diluent):1×10ml/瓶. 5. 辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液 (HRP-avidin Diluent):1×10ml/瓶. 6. 生物素标记抗体(Biotin-antibody):1×120μl/瓶(1:100) 7. 辣根过氧化物酶标记亲和素(HRP-avidin):1×120μl/瓶(1:100) 8. 底物溶液(TMB Substrate ):1×10ml/瓶. 9. 浓洗涤液(Wash Buffer):1×20ml/瓶,使用时每瓶用蒸馏水稀释 25 倍. 10. 终止液(Stop Solution):1×10ml/瓶(2N H2SO4). 需要而未提供的试剂和器材 1. 标准规格酶标仪 2. 高速离心机 3. 电热恒温培养箱 4. 干净的试管和 Eppendof 管 5. 系列可调节移液器及吸头,一次检测样品较多时,最好用多通道移液器 6. 蒸馏水,容量瓶等 标本的采集及保存 1. 血清:全血标本请于室温放置 2 小时或 4℃过夜后于 1000g 离心 20 分钟,取上清即可检测,或将标本 放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融. 2. 血浆:可用 EDTA 或肝素作为抗凝剂,标本采集后 30 分钟内于 2 - 8°C 1000 g 离心 15 分钟,或将标 本放于-20℃或-80℃保存,但应避免反复冻融. 3. 细胞培养物上清或其它生物标本:1000g 离心 20 分钟,取上清即可检测,或将标本放于-20℃或-80℃ 保存,但应避免反复冻融. 注:标本溶血会影响最后检测结果,因此溶血标本不宜进行此项检测. 标本的稀释原则: 首先通过文献检索的方式了解待测样本的大致含量,确定适当的稀释倍数.只有稀释至标准曲线的范围内,
检测的结果才是准确的.稀释的过程中,应做好详细的记录.最后计算浓度时,稀释了"N"倍,标本的浓 度应再乘以"N". 标准品的稀释原则:2 瓶,每瓶临用前以样品稀释液稀释至 1ml,盖好后静置 10 分钟以上,然后反复颠倒/ 搓动以助溶解, 其浓度为 50 ng/ml, 做系列倍比稀释后,分别稀释 50 ng/ml,25 ng/ml,12.5 ng/ml,6.25 ng/ml,3.12 ng/ml,1.56 ng/ml,0.78 ng/ml,样品稀释液直接作为标准浓度 0 ng/ml,临用前 15 分钟 内配制. 如配制 25 ng/ml 标准品:取 0.5ml(不要少于 0.5ml)50 ng/ml 的上述标准品加入含 0.5ml 样品稀释液的 Eppendorf 管中,混匀即可,其余浓度以此类推. 生物素标记抗体的稀释原则: 临用前以生物素标记抗体稀释液稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每孔 100μl), 实际配制时应多配制 0.1-0.2ml.如 10μl 生物素标记抗体加 990μl 生物素标记抗体稀释液的比例配制, 轻轻混匀,在使用前一小时内配制. 辣根过氧化物酶标记亲和素的稀释原则: 临用前以辣根过氧化物酶标记亲和素稀释液稀释,稀释前根据预先计算好的每次实验所需的总量配制(每 孔 100μl),实际配制时应多配制 0.1-0.2ml .如 10μl 辣根过氧化物酶标记亲和素加 990μl 辣根过氧化 物酶标记亲和素稀释液 的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制. 操作步骤 实验开始前,请提前配置好所有试剂,试剂或样品稀释时,均需混匀,混匀时尽量避免起泡.每次检测都 应该做标准曲线.如样品浓度过高时,用样品稀释液进行稀释,以使样品符合试剂盒的检测范围. 1. 加样:分别设空白孔,标准孔,待测样品孔.空白孔加样品稀释液 100μl,余孔分别加标准品或待测 样品 100μl,注意不要有气泡,加样将样品加于酶标板孔底部,尽量不触及孔壁,轻轻晃动混匀,酶标板 加上盖或覆膜,37℃反应 120 分钟. 为保证实验结果有效性,每次实验请使用新的标准品溶液. 2. 弃去液体,甩干,不用洗涤.每孔加生物素标记抗体工作液 100μl(取 1μl 生物素标记抗体加 99μl 生物素标记抗体稀释液的比例配制,轻轻混匀,在使用前一小时内配制),37℃,60 分钟. 3. 温育 60 分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板 3 次,每次浸泡 1-2 分钟,200μl/每孔,甩干. 4. 每孔加辣根过氧化物酶标记亲和素工作液(同生物素标记抗体工作液) 100μl,37℃,60 分钟. 5. 温育 60 分钟后,弃去孔内液体,甩干,洗板 5 次,每次浸泡 1-2 分钟,200μl/每孔,甩干. 6. 依序每孔加底物溶液 90μl,37℃避光显色(30 分钟内,此时肉眼可见标准品的前 3-4 孔有明显的梯度 蓝色,后 3-4 孔显色不明显,即可终止). 7. 依序每孔加终止溶液 50μl,终止反应(此时蓝色立转黄色).终止液的加入顺序应尽量与底物液的加 入顺序相同.为了保证实验结果的准确性,底物反应时间到后应尽快加入终止液. 8. 用酶联仪在 450nm 波长依序测量各孔的光密度(OD 值). 在加终止液后 15 分钟以内进行检测. 注: 1. 用户在初次使用试剂盒时,应将各种试剂管离心数分钟,以便试剂集中到管底. 2. 每次实验留一孔作为空白调零孔,该孔不加任何试剂,只是最后加底物溶液及 2N H2SO4.测量时先用 此孔调 OD 值至零. 3. 为防止样品蒸发,试验时将反应板放于铺有湿布的密闭盒内,酶标板加上盖或覆膜. 4. 未使用完的酶标板或者试剂,请于 2-8℃保存.标准品,生物素标记抗体工作液,辣根过氧化物酶标记 亲和素工作液请依据所需的量配置使用.请勿重复使用已稀释过的标准品,生物素标记抗体工作液,或辣 根过氧化物酶标记亲和素工作液. 5. 建议检测样品时均设双孔测定,以保证检测结果的准确性. 洗板方法 手工洗板方法:吸去(不可触及板壁)或甩掉酶标板内的液体;在实验台上铺垫几层吸水纸,酶标板朝下

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