微全分析系统中的电色谱分离技术 姚波颜流水 王义明 罗国安 3 (清华大学化学系 ,北京 100084) 摘要微全分析系统(μ 2TAS) 近年来发展非常迅速 ,出现了各种各样思路新颖 ,设计独特的芯片分析系统. 本文着重从分离模式方面介绍了 μ 2TAS 的一个新的发展方向 — — — 电色谱.由于电色谱技术兼具高效液相色 谱的高选择性和毛细管电泳的高效性 ,因此具有广阔的应用前景. 关键词 微全分析系统 ,电色谱 ,芯片电色谱 ,评述 2003201224 收稿 ;2004204205 接受 本文系国家自然科学基金资助项目(No. 20290306) 1 引言微全分析系统(micro total analysis system , μ 2TAS) 自20 世纪 90 年代初期提出以来得到了迅速的发 展 ,应用也日趋广泛.就其分离模式而言 ,已经不单纯地局限于最初的毛细管电泳 ,而是出现了色 谱1 ,2 、 凝胶电泳3 、 等电聚焦4 、 基于扩散的分离5 和基于粒子的分离6 等模式.其中由于色谱分离 作为一种比较成熟的技术 ,又较电泳分离具有更高的选择性 ,因此倍受人们关注. 高效液相色谱(HPLC) 是相当成熟的一项分离分析技术 ,具有高灵敏度、 高选择性和适用范围广的特 点.将该技术应用于μ 2T AS 必将有利于其向更广阔的领域发展.但是 ,由于芯片上通道的直径只有几十 μ m 甚至更低 ,填充固定相后有效尺寸显著降低 ,驱动该系统所需要的压力将远高于目前 HPLC 所采用的压 力7 ,成为 HPLC 在μ 2T AS 应用中的很大的障碍.毛细管电色谱(capillary electrochromatography , CEC) 技术 作为一种旨在综合 HPLC 和CE 两者优点的分离技术 ,在解决上述问题的过程中发挥了其独特的优势. CEC 是在毛细管中填充或在毛细管壁涂布、 键合色谱固定相 ,依靠电渗流(electroosmotic flow , EOF) 驱动流 动相使中性和带电荷的样品分子根据它们在色谱固定相和流动相间吸附、 分配平衡常数的不同和电泳速 率的不同而达到分离分析的一种电分离模式.由于 CEC 同时具备 HPLC 的高选择性 CE 的高效性 ,并且 CEC 中产生电渗流为柱塞流 ,其大小几乎不受填充介质颗粒直径的限制7 ,8 ,说明通过降低孔径来提高分 离效率不会降低色谱的驱动力2电渗流 ,从而使 CEC 应用于芯片结构时较 HPLC 更具优势.与CEC 相似芯 片电色谱(chip electrochromatography , ChEC) 技术的关键也是色谱柱 ,目前报道的 ChEC 的柱主要有填充柱、 开管柱、 整体柱和一种基于微加工技术的新型整体柱模式. 2 填充柱电色谱 填充柱是 HPLC 柱的主要类型之一.但是它的主要缺点是在制作过程中要在柱两端烧塞子 ,给柱 子引入了非均匀性因子 ,容易产生气泡 ,导致电渗流中断7 .尽管如此 ,由于填充柱的 HPLC 方法比较 成熟 ,各种填料在市场上易于得到 ,并且批次之间的物理化学性质稳定.Ocvirk 等2 最先在芯片上制作 出带有塞子的 5μ m C18微球填充柱实现微柱液相色谱(μ 2HPLC) ,但由于填充物的均匀程度较差 ,得到的 柱效很低.在此基础上 Verpoorte 等9 将3μ m 粒径 ODS 硅球填入 PDMS 芯片的锥形结构中 ,受Keystone 效应影响微球在锥形结构处被拦截 ,加热固定化制成无塞填充柱 ,50 s 分离了 4 种氨基酸.Oleschuk 等10 ,11 在样品通道中加入两个微堰围出一段 580μ m * 200μ m * 10μ m 的槽结构 ,然后采用电动法将 1~ 4μ m ODS 硅球填入其中.在该芯片系统上实现了固相萃取 (solid2phase extraction , SPF) 预浓集操作 ,对 荧光染料 BODIPY的浓集倍数可达 500 倍.同时 ,该系统还可实现电色谱操作 ,但由于色谱柱长仅为 200μ m ,得到的柱效很低只有 100 理论塔板数 ,又将色谱增加至 5 mm ,分离效率增加到 33012 .Kyung 等13 采用铸模法同样在 PDMS 芯片上面一次性加工出柱塞结构 ,通过施压填充了长3 mm的ODS(i. d. 5 第32 卷2004 年12 月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 评述与进展 Chinese Journal of Analytical Chemistry 第12 期1673~1676 μ m) ,90 s 内分离了两种香豆素. 3 开管柱电色谱 开管柱毛细管电色谱(open tubular capillary electrochromatography , OTCEC) 是为了解决填充柱 CEC 技 术中存在的部分问题(制作工艺复杂 ,易产生气泡等) 而设计的一种电色谱分析技术 ,是在μ 2TAS中最早 得到应用的 CEC 技术11 ,14 ,15 . Jacobson 等在 5μ m 深、 66μ m 宽的玻璃芯片通道中 ,涂渍了 ODS 制成电 色谱芯片 ,150 s 内分离了 3 种香豆素.Kuter16 在芯片上通过控制电压来实现可梯度洗脱的胶束电动 色谱(MEKC) ,接着他们又实现了芯片开管电色谱梯度洗脱分离了 4 种香豆素.与非梯度洗脱相比在更 短的时间内得到了更好的分离效果 ,实际柱效达到 10000017 .Constantin18 在芯片上实现了溶胶2凝胶 法用于 OCEC 柱的制备.由于 OCEC 柱的制备方法简单 ,成功率高 ,近来被用于在芯片上实现二维电泳 操作.二维电泳是以平板凝胶为基质 ,首先采用等电聚焦作为第一维 ,再以聚丙稀酰胺凝胶电泳作为第 二维的一种电泳分离模式 ,通常用于复杂蛋白质及多肽混合物的分离分析19 .Ramsey20 将样品处理、 固相萃取和电色谱分离集成到芯片上 ,采用梯度淋洗 40 s 内分离了 4 种中性化合物.近来也有以柱为 基础实现二维电泳的方法21 .Ramsey 在芯片上先后实现了 MEKC/ CE22 ,23 和OCEC/ CE24 两种二维电 泳方法 ,15 min 内分离了β 2干酪素的胰蛋白酶消解产物 ,实际分离效率达到 23000 (第一维) 和4000 (第 二维) . 4 整体柱电色谱 毛细管电色谱整体柱(monolithic columns) 的成功制备不仅避免了填充柱两端烧塞子的问题 ,同时也 弥补了开管柱相比较低的不足.整体柱通常是在毛细管内经加热和光照原位合成连续床层 ,从而不再 需要在柱两端烧塞子 ,而且柱长也可方便地加以控制.同时可以根据不同样品官能团的需要选择不同 的有机单体及添加剂进行聚合 ,因此 ,该技术近来发展迅速25 ~27 ,其中 UV 光致聚合整体柱在 μ 2TAS 中 应用较多.Yu 等28 研究了毛细管中光致聚合整体柱的性能 ,首先提出由于这类整体柱具有易于成形 , 孔径及表面官能团可控及单体多选择性等优点 ,在μ2TAS 中有很好的应用前景.不久 ,Ericson 等29 在 石英芯片上原位合成了以 PDA(piperazine diacrylamide) 为单体分别带有 SO - 2 、 C- 3 基团的整体柱 ,分别用 于6种烷基酚、 两种三环抗抑郁剂和 4 种标准蛋白质的电色谱和离子交换色谱分离 ,柱效高达 91800. Zare 等30 采用溶胶2凝胶法光致聚合了整体电色谱柱 ,100 s 分离了两种香豆素.Ngola 等27 在石英芯 片通道中分别采用 UV 光致聚合了 4 种丙稀酸单体整体柱 ,并提出通过改变聚合物溶液中 EOF 生成剂 种类来改变整体柱表面电荷的方法 ,使得电色谱可以在酸性条件下进行 ,而不必在流动相中加入 EOF 改性剂 ,又不降低分离效率.这个研究小组采用掩膜严格控制芯片暴露于 UV 光中的部位方法获得所 需的整体柱形状和尺寸31 ,较原来通过注入不同溶液在柱中的方法更准确 ,易于实现 ,便于统一规格. 他们还在玻璃芯片上制成整体电色谱柱32 ,并保留样品通道和检测窗没有固定相 ,保证了快速进样、 换 样和高灵敏度的检测.但是这种非连续固定相在色谱分离过程中由于表面性质不同而产生不同的 ζ 电势导致压力流的产生损失了分离效率.他们还报道了通过将芯片加热至 55 ℃ 来除掉固定相的方法 , 从而使芯片得到再次利用 ,对降低 CEC 芯片的成本有一定意义. 5 COMOSS 整体柱电色谱 Regnier 等33 ~35 报道了 COMOSS(collocated monolith support structures , COMOSS) 的整体柱模式 ,其结 构如图 1 所示.采用深度反应离子刻蚀技术(deep reactive ion etching , DRIE) 在芯片上制成高深宽比 (10 μ m/ 1. 5μ m) 的32 条微通道 ,总宽度为 120μ m ,这些微通道将芯片分割成很多个 5 * 5 * 10μ m 结构的固 定相. 微通道数目最多可达 4096 条36 ,总宽度为 1. 2 cm ,COMOSS 密度超过 4000000/ cm.COMOSS是具 有与填充柱中硅球尺寸相当的固定相 ,与填充柱相比 COMOSS 又具备下述特点 :每个微结构都连结通道 的顶和底 ,具有力学稳定性 ,位置不会随流动相移动而产生变化 ;通道尺寸由制作者预先设计 ,固定单元 在整个通道中均匀有序地分布 ,与填充过程无关.同时 ,COMOSS 也与开管柱类似使用时需进行表面修 4 7 6 1 分析化学第32 卷图1COMOSS 芯片电色谱柱结构示 意 ,摘自文献 31 Fig. 1 Scheme of a collocated monolith sappor structures (COMOSS) separation col2 umn. From 31 饰 ,但它具有比开管柱大得多的表面积和更高相比.32 条微通道 结构的整体柱电色谱柱效可达 170000 plates/ m27 , 与填充柱电色 谱所得柱效相当.He 等37 用C18涂敷的 COMOSS 柱分离了卵白 蛋白的胰蛋白酶消解产物.他们还制成了 PDMS 材质的 COMOSS 整体柱芯片 ,采用 Ce δ 为催化剂在 COMOSS 表面成功地涂敷了 C182AMPS 等5种试剂 ,可以选择性地分离复杂的牛血清白蛋白消 解产物 ,实际柱效可达 2000038 . 6 几种电色谱模式的比较 上面列举的几种微流控芯片电色谱分离模式在加工过程、 分 离性能和样品容量等方面都有各自的特点.尤其是加工制作过 程 ,芯片电色谱充分利用了 MEMS 技术的高精确度 ,设计灵活等 优势 ,突破了某些传统电色谱加工模式的束缚.以填充柱电色谱为例 ,采用微加工技术可将柱塞一次性 地加工在芯片上 ,既保证了加工的重现性 ,又提高了成功率9 ~13 .由于填充柱电色谱同时具备固相萃 取的功能 ,因此可以在柱前进行样品浓集 ,显著提高柱容量9 ,11 .但是 ,目前的填充柱长一般都只有几 mm ,实际柱效也很低 ,阻碍了该电色谱分离模式的发展.与填充柱电色谱相比 ,开管柱电色谱柱长可以 任意增加 ,制备过程简单 ,分离效率较高 ;其缺点是柱容量小.因此 ,开管柱电色谱适合与其它分离模式 联用进行多维电泳/ 色谱分离22 ~24 .COMOSS 整体式电色谱在开管柱基础上 ,利用 MEMS 技术在微通 道中刻蚀出 nm 的微型柱矩阵 ,从而显著提高其柱容量 ,又不改变其传质速度 ,同时能够保证加工的重 复性 ,但是这类芯片造价太昂贵不利于推广使用.整体柱电色谱模式同时弥补了上述两种电色谱的一 些不足 ,可以通过改变聚合物成分组合控制固定相孔径、 带电情况和色谱分离基团 ,因此适用范围更广 ; 不足之处是无论是光引发还是热聚合 ,要求的条件都很苛刻 ,柱与柱之间的重现性也很差.虽然上述几 种微流控芯片电色谱分离模式还存在一些不足之处 ,但是从近几年微全分析技术发展的趋势来看 ,电色 谱分离技术已经开始发挥比单纯的电泳模式更加强大的分离能力 ,正逐步受到广泛的重视. 7 结语除了电色谱技术以外 ,μ 2TAS 还发展了液相色谱39 、 离子色谱15 、 气相色谱40 及自作用色谱41 等 色谱技术.由于电色谱技术采用电渗流作为驱动力 ,比高效液相色谱更有利于实现微型化而不会提高 成本. μ 2TAS 可以在石英、 玻璃、 高聚物等材料上采用微加工手段制成各种各样高精度的微型结构 ,比 毛细管和常规色谱柱更具灵活性 ,使μ2TAS 中的电色谱分离不必拘泥于原有的模式 ,实现更多的功能 , 同时又具备快速、 高效、 低耗、 集成化和微型化等特点.电色谱技术必将成为继毛细管电泳之后应用于 μ 2TAS中的另一种有发展前途的分离分析技术. References 1 Jacobson S C , Hergenr ? der R , K outny L B , Ramsey J M. Anal. Chem. , 1994 , 66 : 2369~2373 2 Ocvirk G, Verpoorte E , Manz A , Grasserbauer M , Widmer H M. Anal. Methods Instrum. , 1995 , 2 : 74~82 3 Bousse L , Mouradian S , Minalla A , Yee H , Williams K, Dubrow R. Anal. Chem. , 2001 , 73 : 1207~1212 4 Macounova K, Cabrera C R , Yager P. Anal. Chem. , 2001 , 73 : 1627~1633 5 Chou C F , Bakajin O , Turner S W P , Duke TA J , Chan S S , Cox E C , Craighead H G, Austin R H. Proceedings of the Nation2 al Academy of Sciences of the United States of America , 1999 , 96 : 13762~13765 6 Han J , Craighead H G. Science , 2000 , 288 : 1026~1029 7 Altria K D. Capillary Electrophoresis Guidebook , Humana Press T otowa , New Jersey 1996 : 197~209 8 Unger K K, Huber M , Walhagen K, Hennessy T P , Hearn M T W. Anal. Chem. , 2002 , 74 : 200A~207A 9 Ceriotti L , de Rooij J F , Verpoorte E. Anal. Chem. , 2002 , 74 : 639~647 10 Oleschuk R D , Shultz2Lockyear L L , Ning Y, Harrison D J . Anal. Chem. , 2000 , 72 : 585~590 5 7 6 1 第12 期姚波等 :微全分析系统中的电色谱分离技术 11 Abebaw B , Jemere R D , Oleschuk F , Fajuyigbe O F , Harrison D J . Electrophoresis , 2002 , 23 : 3537~3544 12 Abebaw B , Jemere R D , Oleschuk D , Harrison D J . Electrophoresis , 2003 , 24 : 3018~3025 13 Kyung W R , Chang W J , K im H , K oo YM , Hahn J H. Electrophoresis , 2003 , 24 : 3253~3259 14 Manz A , Miyaharu J , Miura Y, Watanabe H , Miyagi H , Sato K. Sensor. Actuat. , B1 , 1990 : 249~255 15 Murrihy J P , Breadmore M C , Tan A , McEnery M , Alderman J , O ′ Mathuna C , O′ Neill A P , O′ Brien P , Advoldvic N , Haddad P R , G lennon J D. J . Chromatogr. A , 2001 , 924 : 233~238 16 Kutter J P , Jacobson S C , Ramsey J M. Anal. Chem. , 1997 , 69 : 5165~5171 17 Kutter J P , Jacobson S C , Matsubara N , Ramsey J M. Anal. Chem. , 1998 , 70 : 3291~3297 18 Constantin S , Freitag R , Solignac D , Sayah A , G ijs M A M. Sensor. Actuat. B , 2001 , 78 : 267~272 19 Lukashova I V , K ovalev L I , Efimochkin A S , Shishkin S S. Biochemistry2Moscow , 1994 , 59 : 483~492 20 Broyles B S , Jacobson S C , Ramsey J M. Anal. Chem. , 2003 , 75 : 2761~2767 21 Liu Z Y, Lee M L. J . Microcolumn. Sep. , 2000 , 12 : 241~254 22 Rocklin R D , Ramsey R S , Ramsey J M. Anal. Chem. , 2000 , 72 : 5244~5249 23 Ramsey J D , Jacobson S C , Culbertson C T, Ramsey J M. Anal. Chem. , 2003 , 75 : 3758~3764 24 G ottschlich N , Jacobson S C , Culbertson C T, Ramsey J M. Anal. Chem. , 2001 , 73 : 2669~2674 25 Colon L A , Reynolds KJ , Aliceamaldonado R , Fermier A M. Electrophoresis , 1997 , 18 : 2162~2174 26 Wu R A , Z ou H F , Ye M L , Lei A D , Ni J Y. Anal. Chem. , 2001 , 73 : 4918~4923 27 Ngola S M , Fintschenko Y, Choi W Y, Shepodd TJ . Anal. Chem. ,2001 , 73 : 849~856 28 Yu C , Svec F , Fr ? chet J M J . Electrophoresis , 2000 , 21 : 120~127 29 Ericson C , Holm J , Ericson T, Hjerté n S. Anal. Chem. , 2000 , 72 : 81~87 30 Morishima K, Bennett B D , Dulay M T, Quirino J P , Zare R N. J . Sep. Sci. , 2002 , 25 : 1226~1230 31 Fintschenko Y, Choi W Y, Ngola S M , Shepodd TJ . Fresenius′ J . Anal. Chem. , 2001 , 73 : 174~181 32 Throckmorton D J , Shepodd TJ , Singh A K. Anal. Chem. , 2002 , 74 : 784~789 33 He B , Regnier F. J . Pharmaceut. Biomed. , 1998 , 17 : 925~932 34 He B , Tait N , Regnier F. Anal. Chem. ,1998 , 70 : 3790~3797 35 Regnier F. J . High Resol. Chromatogr. , 2000 , 23 : 19~26 36 Lin S. PhD Thesis , Purdue University , West Lafayette , IN , USA , 1999 37 He B , Ji J , Regnier F. J . Chromatogr. A , 1999 , 853 : 257~262 38 Slentz B E , Penner N A , Regnier F. J . Chromatogr. A , 2002 , 948 : 225~233 39 Bj ? rkman H , Ericson C , Hjerté n S , Hjort K. Sensor Actuat. B , 2001 , 79 : 71~77 40 Noh H S , Hesketh P J , Frye2Mason G C. 15th IEEE international Conference on Micro Electro Mechanical Systems. Technical Di2 gest , 2002 : 73~76 41 Garcí a C D , Hadley D J , Wilson W W , Henry C S. Biotechnol. Prog. , 2003 , 19 : 1006~1010 Development of Electrochromatography on Micro Total Analysis System Technique Yao Bo , Yan Liushui , Wang Y iming , Luo Guoan3 ( Department of Chemistry , Tsinghua University , Beijing 100084) Abstract The development of micro total analysis system (μ 2TAS) technique is very prominent in recent years. More and more novel and practical methods for sample precondition , separation and detection have been established to solve real problems. Electrochromatography , as a new chromatography technique ,is one of the promised separa2 tion techniques suitable for μ 2TAS , because it has not only the high performance efficiency of conventional capillary electrophoresis and high selectivity of high performance liquid chromatography. Latest progress on chip electrochro2 matography is reviewed. Keywords Micro total analysis system , electrochromatography , chip electrochromatography , review (Received 24 January 2003 ; accepted 5 April 2004) 6 7 6 1 分析化学第32 卷
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微全分析系统中的电色谱分离技术 姚波颜流水 王义明 罗国安 3 (清华大学化学系 ,北京 100084) 摘要微全分析系统(μ 2TAS) 近年来发展非常迅速 ,出现了各种各样思路新颖 ,设计独特的芯片分析系统. 本文着重从分离模式方面介绍了 μ 2TAS 的一个新的发展方向 — — — 电色谱.由于电色谱技术兼具高效液相色 谱的高选择性和毛细管电泳的高效性 ,因此具有广阔的应用前景. 关键词 微全分析系统 ,电色谱 ,芯片电色谱 ,评述 2003201224 收稿 ;2004204205 接受 本文系国家自然科学基金资助项目(No. 20290306) 1 引言微全分析系统(micro total analysis system , μ 2TAS) 自20 世纪 90 年代初期提出以来得到了迅速的发 展 ,应用也日趋广泛.就其分离模式而言 ,已经不单纯地局限于最初的毛细管电泳 ,而是出现了色 谱1 ,2 、 凝胶电泳3 、 等电聚焦4 、 基于扩散的分离5 和基于粒子的分离6 等模式.其中由于色谱分离 作为一种比较成熟的技术 ,又较电泳分离具有更高的选择性 ,因此倍受人们关注. 高效液相色谱(HPLC) 是相当成熟的一项分离分析技术 ,具有高灵敏度、 高选择性和适用范围广的特 点.将该技术应用于μ 2T AS 必将有利于其向更广阔的领域发展.但是 ,由于芯片上通道的直径只有几十 μ m 甚至更低 ,填充固定相后有效尺寸显著降低 ,驱动该系统所需要的压力将远高于目前 HPLC 所采用的压 力7 ,成为 HPLC 在μ 2T AS 应用中的很大的障碍.毛细管电色谱(capillary electrochromatography , CEC) 技术 作为一种旨在综合 HPLC 和CE 两者优点的分离技术 ,在解决上述问题的过程中发挥了其独特的优势. CEC 是在毛细管中填充或在毛细管壁涂布、 键合色谱固定相 ,依靠电渗流(electroosmotic flow , EOF) 驱动流 动相使中性和带电荷的样品分子根据它们在色谱固定相和流动相间吸附、 分配平衡常数的不同和电泳速 率的不同而达到分离分析的一种电分离模式.由于 CEC 同时具备 HPLC 的高选择性 CE 的高效性 ,并且 CEC 中产生电渗流为柱塞流 ,其大小几乎不受填充介质颗粒直径的限制7 ,8 ,说明通过降低孔径来提高分 离效率不会降低色谱的驱动力2电渗流 ,从而使 CEC 应用于芯片结构时较 HPLC 更具优势.与CEC 相似芯 片电色谱(chip electrochromatography , ChEC) 技术的关键也是色谱柱 ,目前报道的 ChEC 的柱主要有填充柱、 开管柱、 整体柱和一种基于微加工技术的新型整体柱模式. 2 填充柱电色谱 填充柱是 HPLC 柱的主要类型之一.但是它的主要缺点是在制作过程中要在柱两端烧塞子 ,给柱 子引入了非均匀性因子 ,容易产生气泡 ,导致电渗流中断7 .尽管如此 ,由于填充柱的 HPLC 方法比较 成熟 ,各种填料在市场上易于得到 ,并且批次之间的物理化学性质稳定.Ocvirk 等2 最先在芯片上制作 出带有塞子的 5μ m C18微球填充柱实现微柱液相色谱(μ 2HPLC) ,但由于填充物的均匀程度较差 ,得到的 柱效很低.在此基础上 Verpoorte 等9 将3μ m 粒径 ODS 硅球填入 PDMS 芯片的锥形结构中 ,受Keystone 效应影响微球在锥形结构处被拦截 ,加热固定化制成无塞填充柱 ,50 s 分离了 4 种氨基酸.Oleschuk 等10 ,11 在样品通道中加入两个微堰围出一段 580μ m * 200μ m * 10μ m 的槽结构 ,然后采用电动法将 1~ 4μ m ODS 硅球填入其中.在该芯片系统上实现了固相萃取 (solid2phase extraction , SPF) 预浓集操作 ,对 荧光染料 BODIPY的浓集倍数可达 500 倍.同时 ,该系统还可实现电色谱操作 ,但由于色谱柱长仅为 200μ m ,得到的柱效很低只有 100 理论塔板数 ,又将色谱增加至 5 mm ,分离效率增加到 33012 .Kyung 等13 采用铸模法同样在 PDMS 芯片上面一次性加工出柱塞结构 ,通过施压填充了长3 mm的ODS(i. d. 5 第32 卷2004 年12 月 分析化学 (FENXI HUAXUE) 评述与进展 Chinese Journal of Analytical Chemistry 第12 期1673~1676 μ m) ,90 s 内分离了两种香豆素. 3 开管柱电色谱 开管柱毛细管电色谱(open tubular capillary electrochromatography , OTCEC) 是为了解决填充柱 CEC 技 术中存在的部分问题(制作工艺复杂 ,易产生气泡等) 而设计的一种电色谱分析技术 ,是在μ 2TAS中最早 得到应用的 CEC 技术11 ,14 ,15 . Jacobson 等在 5μ m 深、 66μ m 宽的玻璃芯片通道中 ,涂渍了 ODS 制成电 色谱芯片 ,150 s 内分离了 3 种香豆素.Kuter16 在芯片上通过控制电压来实现可梯度洗脱的胶束电动 色谱(MEKC) ,接着他们又实现了芯片开管电色谱梯度洗脱分离了 4 种香豆素.与非梯度洗脱相比在更 短的时间内得到了更好的分离效果 ,实际柱效达到 10000017 .Constantin18 在芯片上实现了溶胶2凝胶 法用于 OCEC 柱的制备.由于 OCEC 柱的制备方法简单 ,成功率高 ,近来被用于在芯片上实现二维电泳 操作.二维电泳是以平板凝胶为基质 ,首先采用等电聚焦作为第一维 ,再以聚丙稀酰胺凝胶电泳作为第 二维的一种电泳分离模式 ,通常用于复杂蛋白质及多肽混合物的分离分析19 .Ramsey20 将样品处理、 固相萃取和电色谱分离集成到芯片上 ,采用梯度淋洗 40 s 内分离了 4 种中性化合物.近来也有以柱为 基础实现二维电泳的方法21 .Ramsey 在芯片上先后实现了 MEKC/ CE22 ,23 和OCEC/ CE24 两种二维电 泳方法 ,15 min 内分离了β 2干酪素的胰蛋白酶消解产物 ,实际分离效率达到 23000 (第一维) 和4000 (第 二维) . 4 整体柱电色谱 毛细管电色谱整体柱(monolithic columns) 的成功制备不仅避免了填充柱两端烧塞子的问题 ,同时也 弥补了开管柱相比较低的不足.整体柱通常是在毛细管内经加热和光照原位合成连续床层 ,从而不再 需要在柱两端烧塞子 ,而且柱长也可方便地加以控制.同时可以根据不同样品官能团的需要选择不同 的有机单体及添加剂进行聚合 ,因此 ,该技术近来发展迅速25 ~27 ,其中 UV 光致聚合整体柱在 μ 2TAS 中 应用较多.Yu 等28 研究了毛细管中光致聚合整体柱的性能 ,首先提出由于这类整体柱具有易于成形 , 孔径及表面官能团可控及单体多选择性等优点 ,在μ2TAS 中有很好的应用前景.不久 ,Ericson 等29 在 石英芯片上原位合成了以 PDA(piperazine diacrylamide) 为单体分别带有 SO - 2 、 C- 3 基团的整体柱 ,分别用 于6种烷基酚、 两种三环抗抑郁剂和 4 种标准蛋白质的电色谱和离子交换色谱分离 ,柱效高达 91800. Zare 等30 采用溶胶2凝胶法光致聚合了整体电色谱柱 ,100 s 分离了两种香豆素.Ngola 等27 在石英芯 片通道中分别采用 UV 光致聚合了 4 种丙稀酸单体整体柱 ,并提出通过改变聚合物溶液中 EOF 生成剂 种类来改变整体柱表面电荷的方法 ,使得电色谱可以在酸性条件下进行 ,而不必在流动相中加入 EOF 改性剂 ,又不降低分离效率.这个研究小组采用掩膜严格控制芯片暴露于 UV 光中的部位方法获得所 需的整体柱形状和尺寸31 ,较原来通过注入不同溶液在柱中的方法更准确 ,易于实现 ,便于统一规格. 他们还在玻璃芯片上制成整体电色谱柱32 ,并保留样品通道和检测窗没有固定相 ,保证了快速进样、 换 样和高灵敏度的检测.但是这种非连续固定相在色谱分离过程中由于表面性质不同而产生不同的 ζ 电势导致压力流的产生损失了分离效率.他们还报道了通过将芯片加热至 55 ℃ 来除掉固定相的方法 , 从而使芯片得到再次利用 ,对降低 CEC 芯片的成本有一定意义. 5 COMOSS 整体柱电色谱 Regnier 等33 ~35 报道了 COMOSS(collocated monolith support structures , COMOSS) 的整体柱模式 ,其结 构如图 1 所示.采用深度反应离子刻蚀技术(deep reactive ion etching , DRIE) 在芯片上制成高深宽比 (10 μ m/ 1. 5μ m) 的32 条微通道 ,总宽度为 120μ m ,这些微通道将芯片分割成很多个 5 * 5 * 10μ m 结构的固 定相. 微通道数目最多可达 4096 条36 ,总宽度为 1. 2 cm ,COMOSS 密度超过 4000000/ cm.COMOSS是具 有与填充柱中硅球尺寸相当的固定相 ,与填充柱相比 COMOSS 又具备下述特点 :每个微结构都连结通道 的顶和底 ,具有力学稳定性 ,位置不会随流动相移动而产生变化 ;通道尺寸由制作者预先设计 ,固定单元 在整个通道中均匀有序地分布 ,与填充过程无关.同时 ,COMOSS 也与开管柱类似使用时需进行表面修 4 7 6 1 分析化学第32 卷图1COMOSS 芯片电色谱柱结构示 意 ,摘自文献 31 Fig. 1 Scheme of a collocated monolith sappor structures (COMOSS) separation col2 umn. From 31 饰 ,但它具有比开管柱大得多的表面积和更高相比.32 条微通道 结构的整体柱电色谱柱效可达 170000 plates/ m27 , 与填充柱电色 谱所得柱效相当.He 等37 用C18涂敷的 COMOSS 柱分离了卵白 蛋白的胰蛋白酶消解产物.他们还制成了 PDMS 材质的 COMOSS 整体柱芯片 ,采用 Ce δ 为催化剂在 COMOSS 表面成功地涂敷了 C182AMPS 等5种试剂 ,可以选择性地分离复杂的牛血清白蛋白消 解产物 ,实际柱效可达 2000038 . 6 几种电色谱模式的比较 上面列举的几种微流控芯片电色谱分离模式在加工过程、 分 离性能和样品容量等方面都有各自的特点.尤其是加工制作过 程 ,芯片电色谱充分利用了 MEMS 技术的高精确度 ,设计灵活等 优势 ,突破了某些传统电色谱加工模式的束缚.以填充柱电色谱为例 ,采用微加工技术可将柱塞一次性 地加工在芯片上 ,既保证了加工的重现性 ,又提高了成功率9 ~13 .由于填充柱电色谱同时具备固相萃 取的功能 ,因此可以在柱前进行样品浓集 ,显著提高柱容量9 ,11 .但是 ,目前的填充柱长一般都只有几 mm ,实际柱效也很低 ,阻碍了该电色谱分离模式的发展.与填充柱电色谱相比 ,开管柱电色谱柱长可以 任意增加 ,制备过程简单 ,分离效率较高 ;其缺点是柱容量小.因此 ,开管柱电色谱适合与其它分离模式 联用进行多维电泳/ 色谱分离22 ~24 .COMOSS 整体式电色谱在开管柱基础上 ,利用 MEMS 技术在微通 道中刻蚀出 nm 的微型柱矩阵 ,从而显著提高其柱容量 ,又不改变其传质速度 ,同时能够保证加工的重 复性 ,但是这类芯片造价太昂贵不利于推广使用.整体柱电色谱模式同时弥补了上述两种电色谱的一 些不足 ,可以通过改变聚合物成分组合控制固定相孔径、 带电情况和色谱分离基团 ,因此适用范围更广 ; 不足之处是无论是光引发还是热聚合 ,要求的条件都很苛刻 ,柱与柱之间的重现性也很差.虽然上述几 种微流控芯片电色谱分离模式还存在一些不足之处 ,但是从近几年微全分析技术发展的趋势来看 ,电色 谱分离技术已经开始发挥比单纯的电泳模式更加强大的分离能力 ,正逐步受到广泛的重视. 7 结语除了电色谱技术以外 ,μ 2TAS 还发展了液相色谱39 、 离子色谱15 、 气相色谱40 及自作用色谱41 等 色谱技术.由于电色谱技术采用电渗流作为驱动力 ,比高效液相色谱更有利于实现微型化而不会提高 成本. μ 2TAS 可以在石英、 玻璃、 高聚物等材料上采用微加工手段制成各种各样高精度的微型结构 ,比 毛细管和常规色谱柱更具灵活性 ,使μ2TAS 中的电色谱分离不必拘泥于原有的模式 ,实现更多的功能 , 同时又具备快速、 高效、 低耗、 集成化和微型化等特点.电色谱技术必将成为继毛细管电泳之后应用于 μ 2TAS中的另一种有发展前途的分离分析技术. 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Technical Di2 gest , 2002 : 73~76 41 Garcí a C D , Hadley D J , Wilson W W , Henry C S. Biotechnol. Prog. , 2003 , 19 : 1006~1010 Development of Electrochromatography on Micro Total Analysis System Technique Yao Bo , Yan Liushui , Wang Y iming , Luo Guoan3 ( Department of Chemistry , Tsinghua University , Beijing 100084) Abstract The development of micro total analysis system (μ 2TAS) technique is very prominent in recent years. More and more novel and practical methods for sample precondition , separation and detection have been established to solve real problems. Electrochromatography , as a new chromatography technique ,is one of the promised separa2 tion techniques suitable for μ 2TAS , because it has not only the high performance efficiency of conventional capillary electrophoresis and high selectivity of high performance liquid chromatography. Latest progress on chip electrochro2 matography is reviewed. Keywords Micro total analysis system , electrochromatography , chip electrochromatography , review (Received 24 January 2003 ; accepted 5 April 2004) 6 7 6 1 分析化学第32 卷