实验三 细菌的革兰氏染色

(Gram stain)
一,目的要求
了解革兰氏染色的原理;
学习并掌握革兰氏染色的方法.
二,基本原理
革兰氏染色反应是细菌分类和鉴定的重要性状.
它是1884年由丹麦医师Gram创立的.
革兰氏染色法(Gram stain)不仅能观察到细菌的形态而且还可将所有细菌区分为两大类:染色反应呈蓝紫色的称为革兰氏阳性细菌,用G+表示;染色反应呈红色(复染颜色)的称为革兰氏阴性细菌,用G-表示.
细菌对于革兰氏染色的不同反应,是由于它们细胞壁的成分和结构不同而造成的.
肽聚糖(peptidoglycan)
革兰阳性菌肽聚糖—聚糖骨架,四肽侧链,五肽交联桥
青霉素作用点
溶菌酶作用点
N-乙酰葡糖胺
N-乙酰胞壁酸
革兰阴性菌肽聚糖—聚糖骨架,四肽侧链
肽聚糖(peptidoglycan)
革兰阳性菌细胞壁特殊组分
壁磷壁酸
膜磷壁酸
革兰阴性菌细胞壁特殊组分
革兰阳性菌与阴性菌细胞壁结构比较
+
—
脂多糖
+
—
脂蛋白
+
—
外膜
—
+
磷壁酸
占细胞壁干重5%-20%
占细胞壁干重50%-80%
肽聚糖含量
1-2层
可多达50层
肽聚糖层数
10-15nm
20-80nm
厚度
较疏松
较坚韧
强度
革兰阴性菌
革兰阳性菌
细胞壁
革兰氏染色需用四种不同的溶液:碱性染料(basic dye)初染液;媒染剂(mordant);脱色剂(decolorising agent)和复染液(counterstain).
碱性染料初染液——结晶紫(crystal violet)
媒染剂——碘(iodine)
脱色剂——95%的酒精(ethanol)
复染液——番红
三,实验器材
大肠杆菌,枯草芽孢杆菌,未知菌;
草酸铵结晶紫,番水水溶液,碘液,95%乙醇,载玻片,显微镜等.
四,实验步骤
1.涂片:将培养24小时的大肠杆菌和未知菌,培养12-18小时的枯草芽孢杆球菌,分别作涂片(注意涂片切不可过于浓厚),干燥,固定.固定时通过火焰1～2次即可,不可过热,以载玻片不烫手为宜.
2.染色
(1)初染:加草酸铵结晶紫一滴,约一分钟,水洗.
(2)媒染:滴加碘液冲去残水,并覆盖约一分钟,水洗.
(3)脱色:将载玻片上面的水甩净,并衬以白背景,用95%酒精滴洗至流出酒精刚刚不出现紫色时为止,约20～30秒钟,立即用水冲净酒精.
(4)复染:用番红液染1～2分钟,水洗.
(5)干燥和镜检:干燥后,置油镜观察.革兰氏阴性菌呈红色,革兰氏阳性菌呈紫色.以分散开的细菌的革兰氏染色反应为准,过于密集的细菌,常常呈假阳性.
(6)同法在一载玻片上以大肠杆菌与枯草芽孢杆菌混合制片,作革兰氏染色对比.
革兰氏染色的关键在于严格掌握酒精脱色程度,如脱色过度,则阳性菌可被误染为阴性菌;而脱色不够时,阴性菌可被误染为阳性菌.此外,菌龄也影响染色结果,如阳性菌培养时间过长,或已死亡及部分菌自行溶解了,都常呈阴性反应.
大肠杆菌革兰氏染色
炭疽芽胞杆菌
1.结果
列表比较大肠杆菌,枯草芽孢杆菌和未知菌的染色反应,并判断它们分别是G-或G+.
2.思考题
(1)作革兰氏染色涂片为什么不能过于浓厚 其染色成败的关键一步是什么
(2)当你对一株未知菌进行革兰氏染色时,怎样能确证你的染色技术操作正确,结果可靠
五,实验报告