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    细菌形态与结构的检查法
    [适用对象] 中医学(骨伤方向),针灸推拿学专业
    [实验学时] 3学时
    一,实验目的
    1,学会显微镜油镜的使用和保护方法.
    2,认识细菌的基本形态和特殊结构(荚膜,鞭毛,芽胞).
    3,掌握革兰氏染色方法.
    4,了解细菌的动力.
    二,实验原理
    1,显微镜油镜的使用原理: 观察细菌必须用放大1 000倍左右的油镜.油镜的透镜极小,工作焦距最短,光线通过玻璃和空气,由于介质密度不同发生折射,射人镜筒的光线极少,视野暗,物象不清晰.如在玻片与镜头(透镜)之间加上折光率和玻片(n=1.52)相近的香柏油(n=1.515)就可减少光线的折射,加强视野的亮度,获得清晰的物像.
    2,革兰染色法的原理:主要是革兰阳性菌与革兰阴性菌细胞壁有差异,另外革兰阳性菌的等电点比革兰阴性菌低,与碱性染料的亲和力强.
    三,仪器设备
    1,显微镜
    2,细菌标本片:(1)葡萄球菌(革兰染色)(2)大肠杆菌(革兰染色(3)霍乱弧菌(革兰染色)(4)伤寒杆菌(鞭毛染色)(5)肺炎球菌(荚膜染色(6)破伤风杆菌(芽胞染色)
    萄球菌,绿脓杆菌的琼脂斜面18~24小时培养物.
    4,染色液有结晶紫,碘液,95%酒精,稀释石炭酸复红.
    四,相关知识点
    细菌是一类体积微小的单细胞原核细胞型微生物,活的菌体小而透明,当把细菌悬浮于水滴内,用普通光学显微镜观察时,由于菌体和背景没有显著的明暗差,因而难以看清它们的形态,更不易是别其结构,所以,用普通光学显微镜观察细菌时,往往要先将细菌进行染色,借助于颜色的反衬作用,可以更清楚地观察到细菌的形状及某些细胞结构.因此,为了研究细菌的形态特征和鉴别不同类群的细菌,细菌的染色及形态构的观察是位生物学实验中十分重要的基本技术.
    五,实验步骤
    显微镜油镜的使用
    显微镜使用方法
    ①将显微镜平稳的安放在试验台适宜处②用低倍镜对光,调节反光镜,天然光源用平面反光镜,人工光源或光线较弱使用凹面反光镜.检查染色标本要用强光,应将聚光器升到最高,光圈完全开大;若检查未染色的活体标本则用弱光,聚光器适当下降,光圈适当缩小.③标本片上加镜油一滴,转动粗螺旋,使油镜头缓缓下降,用眼从侧面观察,直到油镜头浸入油中接近玻片为止(注意下降油镜头时不要用力过猛过急,以免压碎玻片或损坏镜头).④用左眼从接目镜观察,徐徐转动粗螺旋提升镜头,见模糊物像后再用细螺旋调节即见到清晰物像为止.⑤油镜头使用后应立即用擦镜纸擦净镜头上的油.如油已干,可在镜头纸上滴少许的二甲苯擦拭,并立即用干的擦镜纸擦去二甲苯,因二甲苯能溶解镜头上的固定胶以致使镜片脱落,所以应及时擦去二甲苯.
    显微镜的保护
    ①显微镜是精密仪器,使用时要精心保护,不得随意拆散和碰撞,所有光学部分都不能用手指,布,普通纸擦拭.② 取送显微镜时应右手持镜臂,左手托镜座,平端于胸前.③显微镜的光学部分应避免日光直射.④不用时,将接物镜转开成八字降至最低,使其不对准聚光器,聚光器下降,罩上镜套或放到显微镜箱中.
    观察细菌的基本形态与特殊结构
    1,用油镜观察下列细菌的示教片
    (1)葡萄球菌(革兰染色) (2)大肠杆菌(革兰染色 (3)霍乱弧菌(革兰染色)
    (4)伤寒杆菌(鞭毛染色)(5)肺炎球菌(荚膜染色 (6)破伤风杆菌(芽胞染色)
    注意:各菌的形态,排列和染色性以及特殊结构特点等性状.
    2,将观察到的结果,画在报告纸上并加以适当的描述.
    注意:微生物标本片,多用涂片法制成,观察完毕,不能用力擦去玻片上的镜油,只能用擦镜纸轻轻压吸或滴一滴二甲苯用擦镜纸轻拉.示教片看完处理后应放回原处,自己涂的玻片看完后应放入消毒缸内.
    革兰染色法
    1,细菌标本片的制作
    (1)涂片:无菌操作.取一接种环生理盐水放于载玻片的一端,,用接种环刮取少许绿脓杆菌或葡萄球菌培养物与盐水混匀,涂布成直径约lcm的涂片(若采用液体培养物,勿加生理盐水,直接采取1~2环菌液即可).涂片应薄而均匀.
    (2)干燥:涂片最好在温室中自然干燥.必要时可将标本面向上,在酒精灯上方微火处借热收干.
    (3)固定:标本面向上,在酒精灯火焰外层按钟摆的速度来回通过3次.放置待冷后,进行染色.固定的目的是杀死细菌,使细菌与玻片粘附较牢,在染色时不致于被染液和水冲掉;另外固定能使细菌蛋白质变性,提高细菌对染料的亲和性.
    2,染色

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