小鼠血虚证造模及四物汤治疗的血清白蛋白含量检测
黄玮 摘要:目的:观察分别用乙酰苯肼,环磷酰胺造模小鼠血清白蛋白(ALB)含量的变化,以及 四物汤治疗乙酰苯肼造模小鼠血清白蛋白含量的改变, 并间接评估血清白蛋白作为血虚证小 鼠指标的特异性.方法:溴甲酚绿法(BCG) .结果:只有乙酰苯肼造模使小鼠血清白蛋白 增高(P<0.05) ,环磷酰胺虽然使小鼠血清白蛋白含量降低但无显著差异,四物汤的治疗作 用也不显著.结论:血清白蛋白在乙酰苯肼,环磷酰胺造模小鼠中的变化趋势不一致,因此 单纯以血清白蛋白作为血虚小鼠衡量指标的不合理; 四物汤为补血名方, 但对乙酰苯肼造成 小鼠血虚模型的治疗效果不明显. 关键词:血清白蛋白,血虚证造模,环磷酰胺,乙酰苯肼,小鼠 1,引言: 血虚证是祖国医学的常见证型之一,成因繁多,临床症状复杂,要深入地研究血虚证并 加强其临床治疗效果,有懒于良好的血虚证动物模型的建立.目前,血虚证动物模型(1,5) 的建立方法很多,但存在缺乏统一的衡量指标(3,4) ,血虚的状态不稳定等缺点.本实验 是采用了目前较简便的两种血虚证造模方法:乙酰苯肼,环磷酰胺,进行小鼠造模,结合小 鼠四诊(2) ,血图片,骨髓图片,组织切片等,观察其造模后的血虚表现,以判断是否可纳 入.同时,用补血名方四物汤治疗模型组,反证.以检验,比较两种血虚证造模方法是否成 熟.并且,测定各组小鼠血清白蛋白含量,观察是否有关联的特异性改变,以期找到比较合 理,可靠的生化指标,为判断造模是否成功提供可定量的标准. 2,材料与方法: 2.1 试剂与药物:乙酰苯肼;环磷酰胺粉针剂;白蛋白试剂(溴甲酚绿,柠檬酸,柠檬酸二 钠,Brij-35) ,蛋白标准液 42.0g/L,由上海申索试剂有限公司) ;双蒸水(实验室自备) ;中药 (生地,芍药,当归,川芎各 3g,煎汤 130ml) 2.2 器材:台式离心机, 型号 TDL80-2B(上海安亭科学仪器制造厂) ;722 分光光度仪计(上 海精密科学仪器有限公司) 2ml 比色皿 4 个;震荡器;移液枪 20ul,1000ul 各一把,镊子 ; 3 把,试管,试管架,枪头,卷纸若干 2.3 动物:实验昆明种小鼠,普通级,雄性,40 只 2.4 方法: 分组:将 40 只实验小鼠分为,正常组,环磷酰胺组,乙酰苯肼组,四物汤组 4 组,每 组随机 10 只小鼠. 造模:在 1,4 天用乙酰苯肼 1.7mg/10g 剂量皮下注射造乙酰苯肼组,四物汤组模型, 其它组注射等量生理盐水; 1, 天按环磷酰胺 1mg/10g 剂量腹腔注射造环磷酰胺组模型, 在 2 其它组注射等量生理盐水;同时,四物汤组每天灌服四物汤 0.5ml/只,其他组灌服等量生理 盐水. 采样: 8 天行小鼠摘眼球取血, 第 离心分离出血清. 脱颈椎处死小鼠, 做各项病理检测. 检测:取空白管 1 支,标准管 1 支,测定管 38 支(四物汤组有两只老鼠死亡) ;根据预 实验结果,空白管加入双蒸水 4ul,对照管加入蛋白标准液 4ul,测定管分别加入各小鼠血 清样本 4ul;各管再加入 1000ul 白蛋白试剂;震荡器上混匀,室温放置 10 分钟,以空白管 较零,0.5cm 光径,628nm 处测定吸光度. 白蛋白含量(g/L)=测定管吸光度*标准液浓度/标准管吸光度 (一周后再测一次,其中乙酰苯肼组有一管丢失) 2.5 统计: Excel 简单数据处理,SPSS11.5 软件单因素方差分析,作图 3,结果:
1
组别 四物汤组 第一次测量 34.8373 6.70 30.9685 5.84 40.3270 3.39 * 39.4512 3.07 白蛋白含量 第二次测量 28.0400 3.78 27.0267 4.12 31.8963 2.49* 30.6500 4.05 白蛋白含量 注:* 表示与正常组比较 P〈0.05 表示与环磷酰胺组比较 P〈0.05 & 表示与乙酰苯肼组 比较 P〈0.05
42 33 40 32
表1 正常组
各组小鼠血清白蛋白(g/L)比较 环磷酰胺组 乙酰苯肼组
38
31
36
30
34
29
图 1 第一次测量血清白蛋白柱状图 图 2 第二次测量血清白蛋白柱状图 注:1,2,3,4 分别代表正常组,环磷酰胺组,乙酰苯肼,四物汤组 从表 1 和图 1,2 可以看出:用环磷酰胺造模小鼠血清白蛋白含量普遍降低,但差异不 显著;用乙酰苯肼造模小鼠,血清白蛋白含量普遍升高且与正常组,环磷酰胺组比较都有显 著差异;用四物汤治疗乙酰苯肼造模小鼠,血清白蛋白含量有所降低,但与乙酰苯肼组比较 没有显著差异,同时与正常组也没有显著差异.两次测定,虽然第二次测得值比第一次测得 值要小,但所反应的组间趋势是完全一致的. 在实验过程中,由于操作不当,引起了溶血,为排除溶血对实验结果的影响,故去除溶 血小鼠血清测得值,再做数据统计,得表 2 结果: 表 2 剔除溶血后各组小鼠血清白蛋白(g/L)比较 组别 正常组 环磷酰胺组 乙酰苯肼组 四物汤组 第一次测量 35.7012 7.8902 31.0014 6.2017 40.0830 3.3486 38.6017 3.0039 白蛋白含量 第二次测量 28.3048 4.4159 27.2889 4.2885 33.0933 2.1195 30.9111 4.5727 白蛋白含量 注:* 表示与正常组比较 P〈0.05 表示与环磷酰胺组比较 P〈0.05 & 表示与乙酰苯肼组 比较 P〈0.05 由表 2 可以看出,它和表 1 所反映的组间趋势是一致的,只是乙酰苯肼组和正常组之 间的差异变得不再显著.而去除溶血小鼠血清测得值后,各组的均值都有所升高. 4,讨论: 4.1 白蛋白是血浆的主要蛋白质,约占血浆总蛋白的 60%,是维持血浆渗透压的主要成分. 约 40%的白蛋白存在于血浆中,其余 60%存在于组织间液中.白蛋白还具有结合各种配体 分子的能力,这些配体分子包括非酯化脂肪酸,钙,某些类固醇激素,胆红素一部分血浆中 的色氨酸.在人体铜运输中有重要作用.白蛋白由肝脏合成分泌入血中,半衰期是 13 天, 在慢性肝脏疾病中,血浆白蛋白的含量会降低. (6) 有报道指出:血清白蛋白水平与危重病患者虚实证候间存在相关性,虚证血清白蛋白 含量降低(7,8) . 4.1.1 我们的实验结果是环磷酰胺组小鼠 ALB 下降,虽然没有显著差异.环磷酰胺是抗肿瘤 药,能抑制骨髓造血,对机体是一个整体抑制作用,故小鼠 ALB 下降.参照四诊观察,环 磷酰胺组小鼠主要表现为气虚, 血虚证候在不断加重, 检测时可能小鼠还没达到最理想的血 虚状态,故与正常组对比差异不显著. 4.1.2 乙酰苯肼造模小鼠 ALB 升高,且与正常对照组有显著差异.参照四诊观察,乙酰苯肼

下一页