在合适的时间点检测凋亡
在合适的时间点检测凋亡(上) 作者:TERRI SUNDQUIST, M.S., RICH MORAVEC, B.S., ANDREW NILES, M.S., MARTHA O'BRIEN, PH.D., AND TERRY RISS, PH.D., PROMEGA CORPORATION 凋亡是指与细胞死亡相关的一系列的特定的 细胞形态学变化.我们列出了一些影响因素,这 些因素可能会对凋亡相关的生物化学事件产生的 时间产生影响,并着重阐述在某适合的时间区段 内监测这些生化事件的重要性. 引言 细胞死亡会发生一系列的作用通路不同的细 胞形态学和生物化学变化,包括凋亡,坏死和自 我吞噬(1)."凋亡"这一名词最先由 Kerr 等人(2) 创建,用来描述具有确定的形态学变化的细胞死 亡,包括细胞皱缩,染色质浓集,核膜的完整性 消 失 , 胞 膜 空 泡 化 ( plasma membrane blebbing) ,最后形成凋亡小体.虽然凋亡指的是 纯粹的形态学变化,但是在这些形态学变化中常 伴随着生物化学反应的发生.这些生化反应包括 启始 Caspase 酶和效应 Caspase 酶的激活,线 粒体细胞色素 C 的释放,质膜磷脂酰丝氨酸的外 化,多聚[ADP-核糖]聚合酶(PARP)的降解和核 DNA 的断裂. 这些生物化学事件并不都是凋亡所特有的, 不会在所有的凋亡细胞或凋亡的所有阶段都发 生,也不会在所有凋亡诱导剂刺激时都发生.这 些生化事件发生的时程也有很大差别,并受许多 因素的影响,包括细胞系或组织,凋亡诱导剂, 药物浓度或刺激强度和暴露时间.因此,有策略 地选择检测哪些生化事件就变得十分关键,通过 检测这些生化事件可以证实细胞的死亡是由于凋 亡引起的,同时,还可以了解细胞死亡的动态过 程.本文中我们主要讨论了在适宜的时间段内检 测这些生化事件的重要性,确保这些变化被捕捉 到,而不致错过.我们也列出了一些可能会影响 相关生化事件的检测时限的因素. 细胞凋亡过程中的生化事件的时限 通常,细胞凋亡是通过外部的或内部固有的 途径而进行的.外部(受体介导的)途径涉及受 体结合,激活起始 caspase 酶 ( caspase-8) , caspase-8 继而激活 caspase-3 或者切割 Bcl-2 家族成员 Bid,从而放大 caspase-3 的激活效应; Bid 的切割导致细胞色素 C 漏出, 蛋白复合体 (也 称作凋亡复合体)的形成,以及 caspase-9 的激 活(3) .内部固有(线粒体介导的)途径涉及某 这些成员可以调节细胞色素 C 些 Bcl-2 家族成员, 从线粒体中的释放.细胞色素 C 一旦从线粒体中 释放出来,就会与 Apaf-1,dATP 和 caspase-9 前体形成凋亡复合体. 作为凋亡复合体的一部分, caspase-9 经 过 某 种 处 理 而 被 激 活 , 激 活 的 caspase-9 继而激活 caspase-3.在这两种途径 中,晚期凋亡事件在效应 caspase 酶被激活后发 生,包括质膜外表面磷脂酰丝氨酸的暴露(可通 过锚定蛋白 V 的结合而被检测到) ,多聚[ADP核糖]聚合酶(PARP)的降解和核 DNA 断裂. 生物化学事件发生的精确时间取决于凋亡途
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径.另外,凋亡被诱导后,检测不同的生化事件 或活性的时间点往往也是不同的.例如,使用抗 Fas 单克隆抗体(mAb)处理 Jurkat 细胞,凋亡 的外部通路即被激活,Fas 受体形成三聚体,引 发构象变化,促使死亡诱导信号复合体(DISC) 形成. 使用抗 Fas 单克隆抗体处理 Jurkat 细胞后, caspase-8 活性在处理后 3 小时就达到峰值,而 caspase-3/7 活性在测量的 7 小时内逐渐增加 (图 1) .PARP 在处理后 6 小时达到降解高峰,而晚 期事件-DNA 断裂,直到处理后 9 小时仍没有达 到峰值(图 2) .在最佳测量时间段之前或之后对 这些事件进行检测,都可能导致测量的信号与背 景(比较 1 小时和 7 小时时溶剂对照组和抗 Fas 单克隆抗体处理组的 caspase-8 活性,图 1)相 比太弱或没有,从而导致结论错误,认为该处理 方式不会诱导细胞凋亡.因此,根据经验确定在 什么时候目标活性出现峰值是非常关键的. 所以, 研究者应进行预实验来确定某一检测的最佳时 间,或实验时,确保在足够长的一段时间内进行 检测,并设立多个间隔适当的检测时间点,以捕 捉到活性峰值.
Homogeneous Caspase-3/7 试剂盒检测 caspase-3/7 的 活性,底物为 (Z-DEVD)2-R110.室温孵育 1 小时后,记 录同一孔的发光值和荧光值(4).

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