第18卷第7/8期
2006年8月
化 学 进展
PR0GRESS IN CHEMISTRY
V01.18 No.7/8
Aug.,2006
毛细管电泳无胶筛分介质分离DNA的机理*
周 丹 王延梅一
(中国科学技术大学高分子科学与工程系 合肥230026)
摘 要 快速,高效而灵敏的分离技术对于DNA的分析是至关重要的.使用无胶筛分介质的毛细管电
泳是最重要的DNA分离技术之一,通常使用无交联的高分子溶液作为无胶筛分介质.本文在介绍高分子溶
液理论的基础上,综述了DNA在毛细管电泳无胶筛分介质(缠结溶液和稀溶液)中的分离机理,主要包括
Ogston筛分模型,各种修正的爬行模型,瞬态缠结偶合机理及其改进机理等.
关键词 毛细管电泳DNA分离 无胶筛分介质 高分子溶液 机理
中图分类号:0657.8;Q523文献标识码:A文章编号:1005.281X(2006)07/8.0987—08
Mechanisms of DNA Separation by Capillary Electrophoresis in
Non--Gel Sieving Matrices
Zhou Dan Wang Yanmei
(Depamnent of Polymer Science and Engineering,University of Science and
Technology of China,Hefei 230026,China)
Abstract Fast,highly efficient,and sensitive separation technique is crucial for DNA analysis.The capillary
electrophoresis using non gel sieving matllces is one of the most important techniques for DNA separation.The
uncmsslinked polymer solutions are generally used as sieving tnatrices.Based on the introduction of the theory of the
polymer solutions,the mechanisms of DNA separation by the capillary electrophoresis in non gel sieving matrices
(entangled and dilute solutions)are reviewod in this paper,which includes Ogston sieving model,various modified
reptation models,transient entanglement coupling mechanisms and its improved mechanisms.
Key words capillary electmphoresis;DNA separation;non gel sieving matrices;polymer solutions;mechanisms
1 引言
DNA(deoxyribonucleic—acid)是遗传信息的载体,
是基因的实体.DNA的分离和序列分析是揭开遗
传密码的关键,也是"人类基因组计划"(Human
Genome Project,HGP)的核心研究内容之一….
平板凝胶电泳(slab gel electrophoresis,SGE)曾是
DNA的经典分离方法,通常使用凝胶作为分离介
质.虽然该方法的选择性高,但存在着自动化程度
低,进样量大,凝胶中易产生气泡从而降低分离效率
等缺点;另外,电流通过凝胶时产生的焦耳热效应也
限制了高电压的使用 .
目前,毛细管电泳(capillary electrophoresis,CE)
作为一种高效,微量,高灵敏度及自动化的分离分析
方法,已在医学,生物学等领域受到广泛关注,是分
离带电生物大分子最有效,最广泛的技术之一_3 ].
毛细管电泳是利用被分析离子在电场作用下移动速
率不同而达到分离目的的技术.由于分离介质的性
能直接影响DNA分子的迁移特性,分离度,读出长
度,重现性,注入时间,注入压力以及毛细管寿命等,
收稿:2005年8月,收修改稿:2005年12月
*国家自然科学基金项目(No.50373040),教育部留学回国人员科研启动基金项目和安徽省人才开发资金项目(No.
20057-026)资助
**通讯联系人e-mail:wangyanm@ustc.edu.crl
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化 学进展 第l8卷
因此分离介质的研究是DNA分离与排序工作中最
重要的组成部分之一 .分离介质可分为凝胶筛
分介质和无胶筛分介质两种.前者主要是琼脂糖或
交联聚丙烯酰胺(PAM) ,分离效率高,但毛细管
柱制备困难,凝胶容易断裂和产生空泡,稳定性差,
柱寿命短且重现性不好H ;后者为非交联的高分子
溶液,无复杂的凝胶制备过程,溶液易于充人和洗
出,操作简单,可重复使用且易于实现自动化分离.
常用的无胶筛分介质主要有线形均聚物如线形聚丙
烯酰胺(LPA) ,聚Ⅳ,Ⅳ一二甲基丙烯酰胺
(PDMA)u ,聚氧化乙烯(PEO) ,聚乙烯基吡咯烷
酮(PVP)u ,纤维素及其衍生物" 等,共聚物(无规,
接枝和嵌段共聚物)和混合物等.目前无胶筛分介
质已取代凝胶介质而广泛用于毛细管电泳中,尤其
是近来迅猛发展的毛细管阵列电泳(capillary array
electrophoresis,CAE)和微芯片电泳(microchip—based
eleetrophoresis,MCE) .
目前由于对DNA在高分子溶液中的分离机理
还不很清楚,使得筛分介质的选择有很大的盲目
性 .因此研究DNA在介质中的分离机理对于介
质的选择和制备以及分离条件(如电场强度,分离温
度,介质浓度,缓冲液组成等)的优化都是极为重要
的.同时,DNA分离机理的研究对于定性和定量解
释实验结果也是非常重要的.本文在介绍高分子溶
液理论的基础上,综述了DNA在无胶筛分介质中的
分离机理,主要包括Ogston筛分模型,各种修正的爬
行模型,瞬态缠结偶合机理及其改进机理等.
2高分子溶液理论
De Gennes" 将高分子溶液分为稀,亚浓和浓溶
液3类.在稀溶液中cc )和稀的非缠结的高
分子溶液(c
3.1 DNA在缠结高分子溶液中的分离机理
1991年,Gmssman和Soane_加 开展了高分子溶液
分离机理的理论研究工作.他们认为缠结高分子溶
液中形成的动态"孔"使得DNA分子按照Ogston筛
分(较小的DNA分子)或爬行机理(较大的DNA分
子)进行分离,此后将凝胶电泳模型用于高分子溶液
中.因此可以说用于高分子溶液的Ogston模型以及
各种修正的爬行模型等都是从凝胶电泳机理中发展
而来的.
3.1.1 Ogston模型
首先提出来的用于描述电泳机理的模型是
Ogston模型 ].Rodbard等 一剐于1970年首次将该
模型用于DNA电泳,常用于解释小分子DNA在低
电场下的电泳.Ogston模型将介质对DNA分子的
分离归于筛分过程,假定筛分介质由无规分布的平
均孔径为 的网络构成,并假定DNA分子为 .
( .是DNA分子的旋转半径)恒定的刚性球状无规
线团.DNA分子在电场力的作用下,可扩散直至碰
到一个足够大的允许它通过的"孔",DNA分子通过
该分子筛孔向对应的电极移动,见图2(a)[43.DNA
分子越小则迁移越快,因此较小的DNA分子(R. )则无法迁移通过筛孔,因此该模
型只能解释较小DNA分子的运动,而对较大的DNA
分子无效.Slater等 矧预计在低电场下小分子
DNA片段的log/~( 为电泳淌度)对高分子溶液浓
度c作图为一直线,通常被看作是Ferguson曲线_铷].
3.1.2各种修正的爬行模型
Ogston模型没有考虑到迁移的DNA分子可以
发生形变并以挤压的方式穿过筛孔.因此,Ogston
模型对于DNA分子的 .比网孔孔径大的情况是不
适用的,但实际上此时DNA分子仍可在筛分介质中
得到有效分离.为了解释这种实验现象,提出了多
个基于"爬行"概念的模型.高分子运动的爬行概念
是由de Gennes提出来的¨ ,端部首先迁移即为
爬行.这些爬行模型假定,DNA分子是以线形柔性
链的形式象"蛇"一样爬行通过聚合物网络中的"假
想管子(fictitious tube)",如图3H .DNA分子的淌度
与其片段大小有关,因此可以解释Ogston模型所无
法解释的筛分介质对较大DNA分子的分离.
a Ogston
sacvmg
.j. ' 广
.
. I . . . b reptation
without
orientation
C reptafion
with
orientation
.
.
'
.
'
..
'
'
.
广
图2电泳中的不同迁移区:(a)Ogston筛分;(b)非定向爬
行;(c)定向爬行 ( 代表高分子,凝胶; 代表DNA片
段)"
rig.2 Different reginles of migration in electrophoresis:(a)Ogston
sieving;(b)reptation without orientation;(e)reptation with
orientation.('represent polymer/gel fibres and uu are DNA
fragments)
图3 DNA链(实线)及其"管子"(虚线)在凝胶/聚合物
溶液(小圆圈)中的示意图九
Fig.3 Schemade representation of the DNA chain(solid hne)
and its"tube"(dotted hnes)in the gel/polymer solution(small
cireles)
虽然爬行模型在解释平板凝胶电泳时取得了一
定的成功,但它并不适用于DNA在无交联高分子溶
液中的情况."爬行"运动是假定在极低电场强度下
固定网络中进行的,即链在网络中受到了很大的约
束,每一条链都处在爬行"管子"中,但这个假定与无
交联高分子溶液的实际情况不相符[2].SIater等
也指出,即使非常弱的电场也使链的爬行运动发生
.
. 攀
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990 化学 进展 第18卷
偏移,所以提出了多种修正的爬行模型.
3.1.2.1偏爬行模型(biased reptation model,BRM)
实验观察表明,在较高场强下较大的DNA分子
以恒定淌度迁移时要采用偏爬行模型(BRM) 引,
即在电场方向上发生偏移.BRM描述了DNA链的
偏移运动和无规扩散爬行运动的叠加.当DNA分
子以非定向形式爬行穿过网络时,如图2(b),DNA
可得到较好的分离.而在高场强下,柔性大分子
DNA被拉伸开来,显著地偏离了无规行走,在电场
方向上进行定向运动,如图2(C),在极限情况下甚
至呈现出棒状构象.呈现定向构象的DNA分子在
分离介质中的运动不再采取弯曲的路径,因此对于
高场强下的大分子DNA而言,分离介质的按尺寸分
离能力丧失,并且淌度对分子大小的依赖关系减弱.
爬行概念定性地解释了淌度一DNA大小的s型曲线.
3.1.2.2 波动偏爬行模型(biased reptation with
fluctuations,BRF)
遗憾的是,BRM对长的柔性链的定量预测并不
准确.Duke等 提出了波动偏爬行(BRF)模型,
通过在理论管长中引入"波动"概念从而改进了最初
的BRM.他们重新考虑了电泳迁移过程中固定管
长的假定,并证实由于DNA等带电大分子在管内的
弹性而引起的端部位置的快速波动在迁移机理中起
着至关重要的作用.该模型是与实验数据吻合得最
好的模型之一,Heller等 副的实验以及Barkema
等 和Viovy_柏 的进一步理论研究都证实了BRF理
论的有效性.
3.1.2.3约束释放(constraint l~lease,CR)
"固定的障碍网络(immobile obstacles)"这个假
定对于将凝胶电泳理论应用于高分子溶液是极为重
要的¨ 蚓.上述各种爬行模型可以对高度缠结的高
分子量聚合物溶液的动力学性质进行定性地描述.
但是,对于中等程度缠结的溶液,由于介质中所有高
分子链自身也都进行Brownian爬行运动,所以必须
考虑"管子"的有限寿命.高分子溶液与交联凝胶不
同,链与链之间的物理缠结有一定的寿命.由于形
成管子的高分子链自身的爬行,围绕在DNA周围的
约束管子不是固定的,从而释放高分子网络对DNA
的约束,这个过程称为"约束释放(CR)".Cottet
等H¨利用高分子链的爬行或弛豫时间(对于给定高
分子,随着高分子溶液浓度或分子量的增加而增加,
随着温度的升高而下降)来描述缠结高分子网络的
动力学特性.为了获得均匀的淌度和优良的分离
度,弛豫时间应大于DNA分子在串滴中的停留
时间[41,42].
Viovy和Duke-】副总结得到DNA的总淌度为:
10l= + cR.其中,~-/rap是BRF淌度, cR是约束
释放引起的淌度.理论预测所有的DNA分子 都
是相同的.因此,如果 cR>> ,就不能对DNA
进行分离.唯一可忽略CR的方法就是使用高度缠
结的高分子溶液(如c>>c ).但c>>c'意味着
极小的孔径,这不利于分离较大的DNA片段.所以
最好使用极高分子量的(低分散度)高分子介质,这
样就能得到大孔径和长寿命的缠结H .
Ogston模型和各种爬行模型在高分子溶液中虽
然仍有效,但预测的可靠性下降了,这是因为它们适
用于低电场强度条件和固定的凝胶网络,而无交联
的高分子溶液通常使用较高的电场强度且网络不如
凝胶稳固H .
3.1.3熵屏障模型(entropic barriers)
Muthukumar等 一 提出的熵屏障模型把筛分
介质看成是由"收缩的瓶颈"连起来的"孔穴",当
DNA分子链处于"孔穴"中时获得构型熵,但在迁移
到下一个"孔穴"时需要减少这种熵以挤压通过"瓶
颈".这里"瓶颈"相当于熵屏障,而"孔穴"相当于熵
阱.Zimm等 提出的"湖泊一海峡"模型与此类似.
3.2 DNA在稀溶液中的分离机理
3.2.1 瞬态缠结偶合机理(transient entanglement
coupling,rIEC)及其改进机理
过去曾一度认为介质浓度一定要高于c (即要
形成缠结的高分子网络)才能对DNA进行分离.然
而在1993年,Barton等.柏 发现,dsDNA甚至在浓度
远低于c 的条件下也能被分离.这表明,DNA在
极稀高分子溶液中的分离机理必定与DNA在凝胶
或缠结高分子溶液中的机理不同.随后他提出了一
种简单的"瞬态缠结偶合机理(TEC)",定性地解释
了DNA在极稀的未缠结高分子溶液中的分离,认为
c 不是DNA分离必不可少的条件_49 .Barton指
出当DNA分子在高分子介质中进行迁移时,DNA片
段与高分子链相互缠结或碰撞,被迫拖着它们一起
通过溶液直至相互滑移开,导致DNA的电泳淌度下
降.较大的DNA分子具有更大的可能性与一个或
多个高分子相遇并缠结,因此淌度下降更多,从而可
以按照大小对DNA进行分离.
基于上述DNA和高分子相互作用理论,1996年
Hubert等 提出了一种数学模型来定量解释DNA
片段在极稀高分子溶液中的分离,建立了DNA分子
的淌度与溶液浓度,DNA片段长度以及高分子其它
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第718期 周 丹等毛细管电泳无胶筛分介质分离DNA的机理 991
性质之间的关系式,从而很好地描述了DNA在极稀
高分子溶液中的淌度.用DNA.高分子接触的平均
时间来衡量二者间的相互作用的大小,在此模型中,
聚合物的分子量起着重要的作用.
许多研究者利用视频.显微镜实验证实了稀溶
液中的分离机理 .Todorov等 开发了一种用于
显现用荧光标记的dsDNA在亚浓溶液中三维迁移
的技术,该技术有助于更好地了解有关稀溶液CE
方面的知识.
1998年,Sunada等 蚓用准荧光视频显微镜来
研究DNA分子在极稀溶液中电泳时的动力学行为,
提出了包括DNA.聚合物(低分子量)间的无缠结碰
撞在内的改进的过渡缠结偶合机理.DNA在高分
子量聚合物溶液中进行电泳,无论浓度是大于还是
小于c ,DNA都经历了从致密,球形构象向U.型构
象(拖着缠结的高分子)转变的过程;然而,在低分子
量聚合物溶液中,DNA主要是以球形构象迁移,而
不是形成缠结.小分子DNA和小分子聚合物相遇
时出现非缠结碰撞,该碰撞解释了小分子DNA的分
离.他们提出3类DNA.高分子相互作用形式以解
释这种行为:(1)U.型碰撞,DNA与高分子缠结并以
滑轮运动形式释放DNA分子;(2)短暂碰撞,DNA
与高分子发生短暂缠结,然后再从DNA中释放出高
分子;(3)瞬态非缠结碰撞,球形DNA只是推开高
分子,而DNA和高分子都无变形.不同大小的DNA
分子有不同的碰撞作用和碰撞频率,所以DNA的分
离是完全有可能的.然而,该模型忽略了DNA和高
分子之间的特殊相互作用,如氢键.
2002年,Jung等 在Hubert模型和Sunada模型
的基础上提出了一种数学模型,该模型考虑了毛细
管中分子间的相互作用和DNA.高分子间的碰撞截
面.计算值与实验得到的电泳淌度数据较为吻合.
该模型表明,DNA在缠结的高分子量聚合物溶液中
的分离可以用DNA.高分子的瞬态缠结偶合机理来
解释. Sunada非缠结碰撞出现在小分子DNA和小分
子聚合物之间,可以解释小分子DNA的分离;而
Hubert缠结碰撞可以用于解释通过与大分子聚合物
相互缠结而进行的大分子DNA的分离.基于以上
分离机理,可以解释在实验中观察到的宽范围DNA
分子在宽分子量聚合物溶液(大于或小于c )中的
分离 J.Nkodo等 也表明,该模型适合于大的线
性DNA分子在低于或高于c'的葡聚糖溶液中的分
离.DNA在高分子溶液中的电泳过程中,没有观察
到DNA的爬行,但是构象在球形和变形u.型之间循
环转变 .
Huang等 运用稀溶液瞬态缠结偶合机理很好
地解释了利用纳米粒子填充的毛细管(NFCE)分离
长的dsDNA分子的电泳过程.为了避免金纳米粒
子(GNPs)的聚集并保证其与DNA分子间的相互作
用,用PEO通过非共价键结合生成GNPs/聚合物复
合物(GNPPs)的方法对GNPs进行改性.在电泳分
离过程中DNA分子与它所碰到的吸附在GNPs上的
PEO链短暂缠结.几乎为中性的GNPPs(图4)本身
不流动,并降低DNA的迁移速率.与自由线性高分
图4 GNPPs结构示意图
Fig.4 Proposed schematic illustration of GNPPs[ ]
子相比,吸附在GNPs上的高分子更加刚硬并且伸
展程度较小(取决于GNPs的大小和高分子链的长
度),因而在流动时仅稍稍变形.由于DNA与吸附
在GNPPs上的溴化乙啶(EtBr)之间有强烈的插入作
用,缠结的GNPPs与DNA间的相互解缠结时间会较
长.更重要的是,每个GNPP复合粒子的质量(对于
32 nm GNPs约大于2.0×108 Da/粒子)比线性PEO
分子要大得多,因此它更有能力降低缠结DNA片段
的迁移速率.因为长的DNA片段更有可能与不止
一个的GNPPs作用(取决于DNA的大小和构象),所
以长的DNA片段比短的片段受到的拖拉力更大.
因此,长DNA的淌度小于短DNA,于是DNA按照大
小进行分离.
3.2.2碰撞模型(collision mode1)
Jin等 建立了DNA在稀溶液中的碰撞模型,
得到了DNA淌度与实验条件(包括浓度,温度,电场
强度等)和DNA分子量的函数关系式,并用实验数
据做了初步验证.该模型认为,在极稀的溶液中,高
分子链呈相互独立的无规线团,在电场作用下DNA
无规线团在迁移过程中会与高分子线团发生频繁碰
撞.这种碰撞给DNA的迁移方向和速率带来微观
的不连续影响,从而在表观上阻碍了DNA分子的迁
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化 学 进展 第18卷
移,导致淌度降低.DNA分子越大,它与高分子无
规线团发生碰撞的频率就越高,淌度越低,从而按大
小产生分离.
3.2.3"集体运动"模型(collective motion)
Nkodo等 利用葡聚糖稀溶液对DNA进行电
泳分离,实验结果表明,分离机理可能与紧靠着
DNA无规线团的中性高分子溶液的集体动力学有
关.DNA与它周围的葡聚糖分子产生流体动力学
相互作用,引起它周围的许多额外的葡聚糖分子集
体运动.这或许是一种新的稀溶液分离机理.
3.3分离机理与高分子溶液浓度和DNA大小的
关系 图5显示了分离机理与溶液浓度和DNA大小
的关系 .当c=0时,只能通过端部标记自由溶液
电泳(end.1abeled free solution electrophoresis,ELFSE)
分离DNA,由于ELFSE中不使用高分子介质因此本
文未作讨论;当cc 时,转变为Ogston筛分I和非定向爬行Ⅲ,在
Ⅲ区中DNA像绳子一样穿过障碍物,但并未因为电
场的存在而有明显的定向,DNA的淌度与其大小成
反比.c'取决于分子量.当DNA的旋转半径R.
大于筛分孔径 (取决于聚合物浓度)时,筛分转变
为爬行;当DNA尺寸大于定向爬行临界尺寸肌
时,出现定向爬行Ⅳ,淌度随着电场强度平方的变化
而变化而与DNA大小无关.即所有的DNA都以相
同的速率迁移,凝胶中分离度完全丧失,而高分子溶
液中分离度剧烈下降.随着电场强度的增大(或温
度下降),定向爬行临界尺寸(帆 )变小.Ⅱ区(低
DNA si
Oog(Rv))
cffiO ' c>
hi~Mw lowMw
dilute tamai-dilute Goncentrated
$olubon solution solution solution
图5分离机理(选择性)对溶液浓度和DNA大小的依赖
关系的"相图"[训
Fig.5"Phase diagram"of the dependence of the separation
mech~sm(selectivity)on polymer concentration and on DNA
size[训
分离)只有当DNA大于筛孔径但太刚硬以致于不能
爬行时(b.>R.> )才会出现.b.为DNA的
Kuhn链段长度,等于两倍的持久长度(persistence
length),是聚合物刚性的度量.由于ssDNA链较柔
顺,b.非常小(b.< )所以不会出现Ⅱ区H舟 .
要注意的是,尽管在稀溶液中可以进行DNA的
快速分离,但是由于稀溶液中最快和最慢分析物的
淌度差别小,所以分离度也较小.此外,由于浓度
低,分析物与毛细管壁的吸附问题较严重,造成区带
展宽.因此,只有当对分离度要求不高且需要较高
分离速度时才使用低浓度的高分子溶液进行DNA
分离;另一方面,如果对分离度要求较高,应当使用
较高浓度(缠结)或凝胶状(自缔合)高分子
溶液 .
4结束语
为了提高毛细管电泳的分析效率,Mathies等
采用多根毛细管代替单根毛细管,使样品分离可在
一系列平行石英毛细管内进行,可同时分析多个样
品,实现高速DNA测序,这就是毛细管阵列电泳
(CAE).目前发展迅速的微芯片电泳(MCE)将试样
制备,进样,分离和检测等系统组合在2—3cm芯片
上,实现了现代分析化学的微型化,集成化,一体化
和自动化发展趋势.微芯片可以大幅度地降低进样
体积,分离时间和每次分析的成本 .毛细管阵列
电泳和微芯片电泳都是在毛细管电泳的基础上发展
起来的:因此它们的分离机理也有相同之处.
近几年众多研究者们提出了许多新的分离方
法,主要是利用纳米结构进行分离,如熵基(entropy.
based)分离,表面电泳,磁性自组装筛分,障碍阵列
(obstacle array)等 .由于它们不使用传统的筛
分介质,所以其分离机理与传统毛细管电泳分离机
理有较大的差别.这些新方法还处于研究阶段,到
目前为止还不成熟,但引起了人们的关注.
尽管毛细管电泳技术已成功地应用于人类基因
组计划(HGP),取得了令人惊异的成就,但到目前为
止对它的分离机理仍不很清楚.DNA在介质中分
离机理的研究对于选择和制备介质,改善和优化介
质的筛分性能和筛分条件都是极为重要的.同时,
DNA分离机理的理论工作对于定性和定量解释实
验结果也是非常有用的.只有理论和实践相结合才
能进一步提高DNA的分离和排序性能,才能使毛细
管电泳分离DNA技术更加成熟和完善.
由于链间的物理缠结寿命是有限的,所以DNA
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第7/8期 周 丹等 毛细管电泳无胶筛分介质分离DNA的机理 993
在无交联高分子溶液中的电泳分离机理比在交联凝
胶中的要复杂得多.DNA在缠结溶液中的分离机
理包括Ogston模型以及各种修正的爬行模型等都是
从凝胶电泳机理发展而来的.这些模型在高分子溶
液中虽仍然有效,但可靠性下降了,而且各个模型适
用范围极其有限.DNA在稀溶液中的分离机理主
要是瞬态缠结偶合(TEC)及其改进机理,DNA和高
分子介质在极宽浓度范围内都会发生缠结或非缠结
碰撞,所以用该机理可以解释在实验中观察到的宽
范围DNA分子在宽分子量聚合物溶液(大于或小于
c')中的分离.因此,进一步研究缠结和非缠结碰
撞理论是极有意义的,建立一个独立的DNA电泳模
型也是有可能的.
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