可再生的蛋白富集:标准的分析
为了证明效率和可重现性,在GE Healthcare实验 室中通过运行9个重复的样品进行评估.作为比较, 用Dynabeads Protein A(Invitrogen公司)建立一个 平行实验. 标记Cy5 minimal染料的人运铁蛋白利用多克隆 兔抗人运铁蛋白抗体从无标记的大肠杆菌蛋白的 背景中被富集.对于两种填料,按照交联的操作 步骤,且每种填料根据与相应的产品一起提供的 说明书处理(表2).洗脱的组分用SDS-PAGE (Excel Gel)处理,用Deep Purple总蛋白染料染色后, 在Ettan DIGE Imager扫描仪中扫描. 与Dynabeads Protein A相比,Protein A Mag Sepharose显示出明显较高的回收率,平均回收 率分别为53%和20%(图2).纯度几乎相同,Protein A Mag Sepharose平均纯度为52%,Dynabeads Protein A平均纯度为50%.
ProteinGMagSepharose 基质 配体 结合容量 颗粒大小 工作温度 保存溶液 保存温度 顺磁的,球形的和高度交联的琼脂糖颗粒 天然Protein G 13–22 mg 人IgG/ml胶 37–100 μm 室温 20%乙醇 4℃到8℃
NHSMagSepharose 基质 配体 顺磁的,球形的和高度交联的琼脂糖颗粒 N-羟基丁二酰亚胺
表2.实验条件 ProteinAMagSepharose 分离填料 25 μl胶悬浮液,Protein A Mag Sepharose 样品 的5 mg/ml大肠杆菌蛋白 样品体积 抗体 200 μl Dynabeads Protein A 50 μl胶悬浮液,Dynabeads Protein A 的5 mg/ml大肠杆菌蛋白 200 μl
分钟前稀释2倍(end-over-end).酪氨酸磷酸化蛋 白用2 × 100 μl 100 mM磷酸单苯酯洗脱.在进行 LC-MS/MS分析前进行胰酶消化.未处理的细胞被 制备作为对照. MS鉴定了76个潜在的酪氨酸磷酸化蛋白,其中 54个只在经过过钒酸盐处理的细胞中被发现(数据 没有展示).这些蛋白中的大多数属于粘着斑相关 途径.未处理的细胞仅提供22个蛋白,主要是高 丰度的酶和核糖体蛋白. 与抗pTy抗体相结合,Protein G Mag Sepharose是 一种从大量的起始样品中捕获参与不同的信号途 径的低丰度蛋白的强大工具.
含有7.5 μg/ml人运铁蛋白 含有7.5 μg/ml人运铁蛋白
多克隆兔抗人运铁蛋白抗体 多克隆兔抗人运铁蛋白抗体 150 mM NaCl, pH 7.5 20, pH 8.2 磷酸盐缓冲液(PBS) pH 2.9
结合缓冲液 Tris盐缓冲液:50 mM Tris, 0.1 M 磷酸钠,0.01% Tween 洗涤缓冲液 TBS, 2 M 尿素, pH 7.5 2 M 尿素, pH 2.9
洗脱缓冲液 2 × 50 μl 0.1 M 甘氨酸/ HCl, 2 × 50 μl 0.1 M 甘氨酸/ HCl,
人血浆中血纤维蛋白溶酶原的富集
NHS Mag Sepharose是用于血浆样品中的免疫沉 淀的首选,因为内源性的免疫球蛋白可能结合 Protein A Mag Sepharose或Protein G Mag Sepharose 剩余的自由配体.此外,一些抗体,例如小鼠 IgG1,已知在正常条件下与Protein A 和Protein G 结合很差. 人血浆含有大量的蛋白质,且由于大范围的蛋白 质浓度很难进行工作.免疫沉淀实验证明应用交 联到NHS Mag Sepharose的小鼠单克隆抗体能够 从血浆中有效地富集血纤维蛋白酶原.
图2. Protein A Mag Sepharose(蓝色)与Dynabead Protein A(红 色)之间的比较,(A)回收率,(B)人运铁蛋白纯度.
应用共价交联到NHS Mag Sepharose的抗血纤维 蛋白酶原小鼠IgG1可以从人血浆中富集血纤维蛋 白溶酶原.作为平行实验,相同的抗体被交联到 Protein A Mag Sepharose上.为了提高小鼠IgG1 抗体对Protein A配体的亲和力,抗体首先与1.2 M KH2PO4混合,然后抗体被交联. 为了去除内源性的IgG,样品在HiTrap Protein A HP层析柱上被澄清.来自两个富集实验的组分在 SDS-PAGE上被分析(图3).血纤维蛋白溶酶原进一 步通过LC-MS/MS被鉴定. 两种实验设计确保目标蛋白的高水平富集.Protein A对小鼠IgG1的差的亲和力可将操作步骤稍作修 改而克服.

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